Émission de fluorescence améliorée par cristal photonique et suppression du clignotement pour la biodétection à résolution numérique à point quantique unique

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 4647 (2022) Citer cet article

7414 Accès

20 Citations

15 Altmétrique

Détails des métriques

Alors que les émetteurs quantiques à l'échelle nanométrique sont des balises efficaces pour mesurer les interactions biomoléculaires, leurs utilités pour les applications qui exigent des observations unitaires sont limitées par les exigences des objectifs à grande ouverture numérique (NA), l'intermittence de fluorescence et la faible efficacité de collecte de photons résultant de l'émission omnidirectionnelle. Ici, nous rapportons une amélioration du signal de près de 3000 fois obtenue grâce aux effets multiplicatifs de l'excitation améliorée, de l'extraction hautement directionnelle, de l'amélioration de l'efficacité quantique et de la suppression du clignotement à travers une surface de cristal photonique (PC). L'approche permet d'obtenir une sensibilité à un seul point quantique (QD) avec un rapport signal sur bruit élevé, même en utilisant une lentille à faible NA et une configuration optique peu coûteuse. La capacité de suppression du clignotement du PC améliore la ponctualité des QD de 15 % à 85 %, améliorant ainsi l'intermittence du signal. Nous avons développé un test pour les biomarqueurs de miARN associés au cancer avec une résolution à une seule molécule, une sélectivité de mutation à une seule base et une limite de détection de 10 atomolaires. De plus, nous avons observé des trajectoires de mouvement de surface différentielles des QD lorsque leur stringence de fixation de surface est modifiée en modifiant une seule base dans une séquence de miARN spécifique au cancer.

Les rapporteurs fluorescents chimiques et à base de nanoparticules sont des composants largement utilisés dans la recherche en sciences de la vie et les diagnostics moléculaires. Les balises génératrices de photons permettent la visualisation et la quantification des analytes biologiques en fixant le rapporteur à une molécule cible, suivies d'une détection avec un instrument qui excite la fluorescence tout en recueillant l'émission de photons dans un capteur optique. Les QD colloïdaux offrent une large gamme de propriétés optiques utiles pour les dosages numériques avec des lectures de molécules uniques, y compris des coefficients d'absorption élevés (>107 M–1 cm–1), des bandes d'émission étroites et largement accordables, une photostabilité élevée et une efficacité quantique élevée. L'amélioration des rapporteurs fluorescents grâce à des intensités de champ électromagnétique localement améliorées par des surfaces plasmoniques et des nanostructures s'est avérée être une stratégie efficace pour réduire les limites de détection dans les essais biomoléculaires1,2,3,4,5,6, en particulier pour les essais qui détectent les agrégats de nombreux fluorophores , dont l'émission est combinée pour produire des signaux détectables au-dessus de la fluorescence de fond et du bruit de tir des photodétecteurs7,8,9,10. Les stratégies de test courantes incluent l'agrégation de nombreux fluorophores ensemble (par exemple, une tache de microréseau) ou l'utilisation d'une amplification enzymatique pour générer de grandes quantités de reporters fluorescents à partir d'un seul analyte.

Ces dernières années, de nombreuses recherches ont abordé le problème de l'amélioration de l'excitation de reporters fluorescents uniques, de la collecte efficace de leur émission de photons et de la génération de signaux permettant de les observer en présence d'une variété de sources de bruit. La microscopie par fluorescence à réflexion interne totale (TIRF), par exemple, peut atteindre une résolution de fluorophore unique en utilisant des objectifs coûteux à immersion dans l'huile à haute NA et des caméras à couplage de charge à multiplication d'électrons (EM-CCD) pour fournir une augmentation de plus de 30 fois du signal à -rapport de bruit11, 12. Les nanostructures plasmoniques13,14,15,16,17,18 se sont avérées efficaces pour l'amélioration localisée de l'intensité d'excitation du champ électrique avec un facteur d'amélioration de la fluorescence de ~100 à ~1000, bien que de nombreuses structures plasmoniques souffrent d'une forte non- décroissance radiative due aux pertes intrinsèques dans le métal, à la trempe et à la faible directivité des photons émis16. De plus, la longueur d'onde de résonance de ces nanostructures est fixée par la taille, la forme et le matériau des nano-résonateurs. Les premières approches pour exciter les reporters fluorescents avec des microcavités optiques diélectriques démontrent des améliorations modestes du taux d'émission19,20,21. Une limitation des microcavités diélectriques est le décalage entre les résonances à Q élevé de la cavité et l'émission spectralement large des émetteurs fluorescents élargis de manière inhomogène à température ambiante. Des rapports récents sur l'amélioration du champ électromagnétique avec un nano-gap hybride plasmonique-diélectrique et des dalles de nanofils diélectriques22 ont abordé ces problèmes et montrent une amélioration d'environ 1000 ×, mais avec un petit nombre de points chauds très localisés qui n'occupent qu'une petite fraction de la surface totale zone. Néanmoins, un alignement précis entre les émetteurs de fluorescence et les modes de cavité est nécessaire pour obtenir des facteurs d'amélioration aussi élevés grâce à une nanofabrication sophistiquée. Pour surmonter ces problèmes, nos recherches précédentes ont utilisé une approche basée sur la microscopie pour l'amélioration de la fluorescence à partir d'une surface de PC sur des surfaces étendues. Une augmentation de 60 fois de l'intensité de la fluorescence a été rapportée à partir d'une couche de streptavidine conjuguée au Cy-5 sur un PC23 unidimensionnel. Cette amélioration peut être améliorée jusqu'à 360 fois en couplant le mode de fuite PC à une cavité sous-jacente de type Fabry-Perot via un réflecteur miroir en or24. Une amélioration de la fluorescence de 108 × pour une couche de QD a été rapportée en utilisant une extraction de fluorescence assistée par mode de fuite à partir d'une surface de PC bidimensionnelle25. Plus récemment, Yan et al. ont démontré un PC à hétérostructure multiple avec une bande d'arrêt super large pour obtenir une amélioration de la fluorescence à large bande de plus de 100 fois26, ce qui nécessitait une fabrication compliquée couche par couche de monocouches cristallines colloïdales 2D auto-assemblées. Des structures PC tridimensionnelles ont également été utilisées pour améliorer la fluorescence. Song et al. enduit par centrifugation d'une couche de colorant Ru sur des PC opales 3D composés de multicouches de sphères de PMMA pour obtenir une amélioration de la luminescence d'environ 320 fois avec des configurations à double bande d'arrêt27.

Alors que plusieurs classes importantes de biomarqueurs du cancer à faible concentration (protéines, ADN tumoral circulant, ARN long non codant, lipides et métabolites) font actuellement l'objet d'une intense activité de recherche et de validation clinique, nous nous concentrons ici sur la détection des microARN circulants (miARN, miR). Avec l'augmentation importante de la biopsie liquide, les miARN peuvent servir de biomarqueur clinique prometteur du cancer, de nombreuses études corrélant la concentration de miARN à des conditions de santé spécifiques telles qu'un type de cancer particulier ou un état métastatique28,29,30,31. Le potentiel de détermination sensible et quantitative de la concentration de biomarqueurs de miARN à partir de sérum humain sur une base fréquente est une étape vers la détection précoce du cancer, la surveillance du traitement, le pronostic et la prédiction des résultats du traitement souligne davantage la nécessité d'un système de haute performance peu coûteux et simple dosages32. Nos efforts et d'autres ont fourni des preuves que les concentrations de biomarqueurs miARN en circulation stratégiquement choisies sont liées aux résultats cliniques. Par exemple, en séquençant le contenu en ARN des exosomes plasmatiques, notre équipe a découvert deux miARN, miR-375 et miR-1290, qui sont fortement associés aux résultats cliniques chez les patients atteints d'un cancer de la prostate métastatique au moment de développer une résistance à la castration (mCRPC)33. La détection de miARN à très faible concentration et avec une discrimination à base unique sans l'implication du séquençage de l'ARN (qui nécessite un équipement sophistiqué, de grands volumes d'échantillons et un traitement élaboré des échantillons) représente un important besoin non satisfait dans la pratique clinique actuelle.

Malheureusement, le protocole standard d'isolement et de purification de l'ARN du sang total suivi de l'identification de la cible par PCR quantitative de la transcriptase inverse (qRT-PCR) demande beaucoup de travail, nécessite une amplification enzymatique et peut souffrir de biais de séquence34, 35. En pratique, la qRT-PCR les tests nécessitent des amorces uniques et des méthodes d'amplification pour les courtes séquences cibles de miARN, ce qui les empêche d'analyser de petits volumes36, tandis que les approches basées sur le séquençage (RNA-Seq) nécessitent un traitement élaboré des échantillons, un équipement coûteux, de longs temps d'attente et une expertise en bioinformatique, ce qui limite leur utilisation. Pour qRT-PCR37, une sensibilité élevée est obtenue grâce à une amplification enzymatique qui nécessite à la fois une conversion en ADN (transcription inverse) et une amplification enzymatique jusqu'à la fin pour plus de précision. Les approches de gouttelettes numériques ont considérablement amélioré l'analyse quantitative des échantillons biologiques à faible volume. Cependant, des défis similaires limitent la lecture des dosages qRT-PCR de miARN sous forme de gouttelettes, aggravés par le faible débit de partitionnement des gouttelettes, le coût de l'équipement, la petite plage dynamique et les étapes complexes d'analyse des données. Les capteurs électrochimiques sont capables d'une détection miR ultrasensible (<1 pM)38 et sans amplification avec une simple lecture39,40,41 mais ont une plage restreinte de température de fonctionnement42. Néanmoins, le développement d'un test de diagnostic moléculaire ultrasensible et hautement spécifique à la cible est nécessaire pour discriminer efficacement les acides nucléiques de séquences similaires à de faibles concentrations. En outre, un test de diagnostic qui ne nécessite pas d'amplification enzymatique est souhaitable pour une utilisation au point de service. Le développement de diagnostics rapides et rentables est essentiel pour la diffusion des technologies pour les applications cliniques dans de vastes environnements de soins43.

Dans ce travail, nous présentons une stratégie de détection pour la détection hautement spécifique d'une cible de miARN spécifique au cancer en fournissant une résolution numérique de molécules individuelles avec un rapport signal/bruit élevé optiquement amélioré. Dans l'ensemble, grâce à l'ingénierie des facteurs de qualité, nous obtenons une amélioration d'environ 3000 × de l'intensité des photons détectés à partir d'étiquettes QD individuelles (par rapport à la détection de QD sur une surface de verre ordinaire et sans motif), en utilisant une caractérisation expérimentale soutenue par des simulations électromagnétiques pour attribuer un gain de 23 × à une excitation améliorée, un gain de 39 × à une extraction améliorée (comprenant à la fois l'amélioration du taux d'extraction des photons et le changement d'efficacité quantique via l'effet Purcell) et un gain de 3,5 × à une efficacité de collecte améliorée. De plus, la capacité de suppression du clignotement du PC améliore les QD dans le temps de 15 % à 85 %, fournissant ainsi une méthode pour améliorer les problèmes d'intermittence du signal rencontrés lors des mesures ultrasensibles tout en facilitant le suivi de mouvement rapide au niveau d'une seule particule. Ici, en exploitant ces propriétés synergiques, nous montrons que le système PC-QD peut atteindre une sensibilité QD unique avec un rapport signal/bruit élevé (~ 59) en utilisant une lentille NA faible (NA = 0,5, 50 ×) sans TIRF ou haute appareil photo multiplicateur d'électrons à gain. Notre exploration des principes physiques pour améliorer l'excitation, l'extraction, le taux d'émission et l'efficacité de collecte des QD individuels est motivée par notre désir de développer des méthodes plus sensibles, quantitatives et simples pour détecter les biomarqueurs liés au cancer dans des échantillons cliniques à faible volume. Un autre aspect de cette étude est l'utilisation de la capacité d'imagerie à un seul QD pour un test biomoléculaire à résolution numérique qui a réalisé une détection sensible et sélective d'un biomarqueur de miARN qui peut être adapté pour détecter d'autres miARN ainsi que des ADN et des protéines. Dans ce rapport, nous utilisons le système PC-QD pour mettre en œuvre un test de miARN en deux étapes hautement spécifique à température ambiante à partir d'un volume d'échantillon de 45 μL pour fournir une résolution numérique des molécules cibles individuelles, ce qui entraîne une limite de détection d'environ 10 aM, base unique -sélectivité de mésappariement de paires et plage dynamique élevée (9 ordres de grandeur). Fait intéressant, en utilisant la capacité de suppression de clignotement dans le suivi des particules uniques, notre système d'imagerie est capable d'enregistrer la trajectoire dynamique de QD uniques, grâce à laquelle nous pouvons discriminer une seule différence de base dans une molécule de miARN cible en 10 minutes sans étape de lavage. Notre stratégie de détection simple, sensible, quantitative et à faible volume des miARN est dictée par les besoins cliniques en matière de diagnostic au point de service. Pour éviter les non-linéarités inhérentes aux amplifications enzymatiques en plusieurs étapes, nous utilisons une détection optique à point final unique à l'aide d'étiquettes QD et d'une surface PC pour faciliter l'imagerie signal sur bruit élevée des QD individuels attachés à la surface, ce qui permet de compter directement les miARN.

Au-delà des rapports antérieurs sur l'amélioration des points quantiques (QD) par les surfaces PC1, notre objectif actuel est de construire une surface nanostructurée PC nouvellement conçue qui peut servir de substrat macroscopique à usage général pour la microscopie à fluorescence des étiquettes QD avec une fabrication simple et peu coûteuse processus et facteur d'amélioration grandement amélioré. Comme le montrent les Fig. 1a, b, nous avons conçu un instrument capable d'augmenter l'intensité de l'émission QD de 3 000 fois, ouvrant ainsi la possibilité d'imager des QD uniques à l'aide d'objectifs à faible NA (NA = 0, 5, 50 ×), sans avoir besoin de une lentille NA élevée à immersion dans l'huile (généralement NA ~ 1,46) et un instrument TIRF sophistiqué. Une amélioration beaucoup plus importante est obtenue grâce à l'ingénierie radiative, où le réglage précis de deux facteurs de qualité de rayonnement (Qr) et de non-rayonnement (absorption ou perte inévitable causée par des imperfections de fabrication, Qnr) pour correspondre l'un à l'autre. Les exigences de correspondance Q (Qr = Qnr) doivent être satisfaites pour deux modes de résonance PC (mode pompe et mode fluorescence), afin de maximiser le facteur d'amélioration vers les limites théoriques. Cette amélioration de 3000 × est également attribuée à l'intégration de facteurs d'amélioration multiplicatifs pour fournir une amélioration complète depuis le processus de génération de fluorescence (absorption, durée de vie à l'état excité, émission de fluorescence radiative) jusqu'au processus de collecte (distribution en champ lointain et réduction du clignotement ) après la génération des photons d'émission.

a Schéma de la conception du test de pont et de l'approche de détection par comptage numérique miR améliorée par résonance PC-QD utilisant une amélioration de la fluorescence 3000 × avec une coupe en z fine et une suppression des clignotements. Les composants des diagnostics numériques miRNA améliorés par PC-QD sont présentés dans la partie supérieure, où la sonde ssDNA (bleue) est fonctionnalisée sur une surface QD-streptavidine avec un rapport ~ 10: 1. Sur la base de la simulation NUPACK, la longueur du brin de capture (jaune) est fixée à 10 bases (couple avec la partie inférieure de la cible) tandis que la longueur de la sonde est de 12 bases (couple avec la partie supérieure de la cible), pour un total de 22 bases de paires complémentaires pour une double hybridation avec le miARN cible 375 (rose). Dans le processus de dosage activé par pont, les étiquettes QD seront tirées vers la surface du PC lorsque les miARN cibles forment un complexe lié à la surface. b Les QD capturés en surface bénéficient d'une amélioration de 3000 × par rapport aux QD flottants non capturés. Le fort facteur d'amélioration permet une imagerie QD unique en utilisant uniquement un objectif NA = 0,5. Un exemple d'image à balayage linéaire PCEF est illustré à gauche. Image capturée à l'aide d'une caméra EMCCD (Hamamatsu) avec gain = 1, gain de sensibilité = 100 (gain EM 40× sur 1200×), temps d'intégration = 600 ms. Puissance laser = 1 mW. Objectif : ×50, NA = 0,5. Mode pompe PC : sur résonance. Les traces temporelles des intensités ponctuelles limitées par la diffraction (à droite) sont utilisées pour identifier les QD uniques par leurs distributions d'intensité à deux niveaux distinctes (lentille d'objectif : × 50, NA = 0,5). c Illustration du champ d'excitation amélioré. Les flèches rouges indiquent les émissions QD. d Illustration d'un taux d'extraction et d'une efficacité de collecte améliorés. Les zones oranges montrent la distribution spatiale des émissions QD sur le verre et le PC. Les reflets jaunes à l'intérieur du PC indiquent la distribution du profil de mode de son mode de fluorescence. Les photons émis par QD sont d'abord couplés au mode de fluorescence du PC qui re-rayonne avec un taux d'extraction plus élevé vers le champ lointain à un angle d'ingénierie qui est englobé par la plage de collecte de l'objectif (gris clair). e Illustration du taux d'émission spontanée amélioré et de la suppression du clignotement.

L'interaction de la lumière avec les marqueurs QD fluorescents peut être considérablement modifiée en présence de résonances optiques25, 44, 45 par cinq mécanismes : (i) amélioration de l'absorption des molécules (taux d'excitation) en couplant le champ de pompe d'excitation dans un mode de résonance par rapport avec absorption en masse (Fig. 1c), (ii) amélioration du taux d'extraction des photons générés dans le champ lointain en présence de PC par rapport à placé dans l'espace libre (Fig. 1d), (iii) amélioration de l'émission spontanée taux et efficacité quantique radiative en modifiant l'environnement photonique des émetteurs par rapport à un environnement non modificateur46 (Fig. 1e), (iv) amélioration de l'efficacité de collecte en redirigeant la lumière émise dans les directions de couplage de sortie préférées (Fig. 1d), et (v) suppression du clignotement (Fig. 1e). Tout d'abord, le PC est conçu pour prendre en charge un mode pompe optique résonant à la longueur d'onde de l'éclairage laser, et à son tour, pour générer un champ électromagnétique amélioré pour exciter les QD attachés à la surface. Le mécanisme d'excitation amélioré permet une absorption substantielle de l'énergie de pompe pour les QD au voisinage de la surface du PC et génère plus de photons que les mêmes QD en contact avec une surface de verre sans motif. Deuxièmement, la lumière d'émission QD se couple avec le mode fluorescent PC et rayonne dans le champ lointain à un taux d'extraction plus élevé, de sorte que plus de photons sont capturés pendant un seul temps d'intégration d'image. Troisièmement, le PC diélectrique produit une amélioration de l'efficacité quantique grâce à l'effet Purcell, ce qui se traduit par une durée de vie d'émission spontanée réduite et une efficacité quantique plus élevée. Quatrièmement, les modes de résonance PC fournissent une dispersion photonique qui dicte la distribution angulaire hautement directionnelle des photons dans l'espace libre. Le mécanisme d'émission directionnelle assure une plus grande efficacité de collecte de photons à partir du PC, grâce à la sélection stratégique d'un objectif de microscope dont NA intègre les angles pour une longueur d'onde d'émission QD connue. En outre, nous démontrons que la présence de QD sur le PC entraîne la suppression du clignotement du QD dans lequel le QD reste dans son état « activé » pendant une plus grande fraction du temps. Un élément clé de l'étude actuelle réside dans la combinaison de plusieurs effets multiplicatifs indépendants qui utilisent une surface PC pour obtenir une amélioration sans précédent de 3000 × dans l'émission QD avec suppression du clignotement, ce qui permet l'observation de QD individuels en utilisant un objectif NA faible tout en maintenant un niveau élevé. rapport signal sur bruit, un grand champ de vision et une amélioration des problèmes d'intermittence du signal.

L'amélioration de l'excitation se produit lorsque le PC prend en charge un mode de résonance de pompe à la longueur d'onde du laser d'excitation, ce qui améliore le champ électrique local (Fig. 1c). Le système PC-QD (voir Fig. S1a – e supplémentaire) est composé de QD liés par des liaisons biomoléculaires à la surface d'une dalle de PC diélectrique. La figure 2a montre une image représentative au microscope électronique à balayage (SEM) du système PC-QD. La dalle PC prend en charge les résonances guidées par cristal photonique (PCGR) dans un revêtement à couche mince de Si3N4 (n = 2,05) sur un substrat de SiO2 modulé périodiquement (n = 1,46). La surface est immergée dans un milieu aqueux et excitée par l'arrière avec un laser polarisé électriquement transversal (TE-) (λlaser = 450 nm) à l'angle d'incidence θ. Lorsque l'angle d'incidence du laser satisfait à la condition d'accord de phase du PC, il sera couplé en tant que modes guidés se propageant via la diffusion de Bragg du premier ordre47. La lumière d'excitation se propage ensuite à l'intérieur du PC par la voie de transport assistée par résonance et forme des `` modes propres qui fuient '' qui sont confinés le long de la surface supérieure du PC (s'étendant dans le milieu aqueux de couverture) pour une durée de vie finie τ avec une résonance en forme de ligne lorentzienne accordable dans le domaine fréquentiel19. Avec une énergie d'entrée continue provenant de la lumière incidente, le PC sert de cavité optique résonnante qui stocke l'énergie des photons. En conséquence, le champ d'excitation local peut être d'un ordre de grandeur supérieur à celui d'une surface ordinaire sans motif (Fig. 2b) et peut donc conduire à une meilleure absorption des QD attachés à la surface48. À la résonance, une forte intensité de champ proche est créée près de la surface et le mode de résonance s'étend sur toute la surface macroscopique à travers les queues de champ évanescent (Fig. 1c). Cette propriété délocalisée a ouvert des approches permettant au PC d'interagir facilement avec les balises QD ajoutées n'importe où sur la grande surface du PC (dans le plan x-y) à proximité dans la direction z (<100 nm, section z fine).

une image SEM du système couplé PC-QD à un grossissement de 40k. Barre d'échelle, 1 µm. L'encart de gauche montre une zone agrandie pour les détails à un grossissement de 130k avec une barre d'échelle de 100 nm. L'encart de droite montre une image TEM du QD-605 à un grossissement de 600k. Barre d'échelle, 10 nm. Plus de trois expériences ont été répétées indépendamment avec des résultats similaires. b Simulation FDTD de la distribution d'intensité en champ proche de la section efficace du PC, à la fois en résonance (θ = 9,2 °, à gauche) et hors résonance (θ = 20 °, à droite). c Mesures du spectre d'émission à résolution angulaire pour QD-605 lorsqu'il est couplé au mode fluorescent amélioré (vert) et solitaire sur verre (bleu), tous deux avec un angle de collecte = 26°. d Panneau supérieur : simulation numérique pour la cartographie 2D du facteur d'amélioration de Purcell (Fp) en fonction de la position sur la surface du PC. Un seul dipôle est utilisé et supposé être orienté dans la direction x. Panneau inférieur : Imagerie topographique pour la surface du PC à l'aide d'un microscope à force atomique (AFM), x = 1,13 μm, y = 0,4 μm, la hauteur z varie de 0 nm (rainure) à 28 nm (crête). e Diagramme de rayonnement en champ lointain simulé à partir de la surface du PC (courbe bleue) et du verre (courbe rouge). Les régions blanches représentent les régions angulaires qui sont collectées par NA = 0,5. f Simulation de spectres de réflexion PC résolus en angle (structure de bande).

Étant donné que le chevauchement spatial entre les QD (rayon moyen ~ 4 nm) et le mode de résonance de pompe est généralement faible par rapport à la longueur d'onde, seule une petite fraction de l'énergie d'excitation est absorbée45. Ici, nous définissons la puissance absorbée par une seule couche de QD comme \({P}_{{{\rm {Glass}}}}^{{{\rm {abs}}}}=\left({N}_ {0}{\sigma }_{{{\rm {QD}}}}d\right)\times {P}_{{{\rm {in}}}}\), où σQD est la croix d'absorption section de molécules, N0 est la densité numérique des molécules, d est l'épaisseur de la couche unique QD et Pin est la puissance de la pompe d'excitation. À partir du modèle de la théorie des modes couplés temporels (TCMT)20, 21, nous définissons le facteur d'amélioration de l'excitation comme suit :

Le terme de rapport \({({Q}^{{\rm {P}}})}^{2}/{Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {P}}} \) décrit la quantité d'énergie d'excitation d'entrée stockée dans la résonance optique via le mode de résonance de pompe. Nous avons appliqué le facteur de confinement d'énergie \({\alpha }^{{\rm {P}}}={\int }_{{\rm {QDlayer}}}{|{{{{{{\bf{E} }}}}}}_{{{{{\bf{k}}}}}},{\omega }_{{{{{{\bf{k}}}}}}}}^{{ \rm {P}}}({{{{{\bf{r}}}}}})|}^{2}{\rm {d}}{{{{{\bf{r}}}} }}\) pour caractériser la proportion de l'énergie stockée en mode susmentionnée localisée dans la couche QD tandis que \({{{{{\bf{E}}}}}}}_{{{{{\bf{ k}}}}}},{\omega }_{{{{{{\bf{k}}}}}}}}^{{\rm {P}}}({{{{{\bf{ r}}}}}})\) est le champ électrique normalisé du laser de pompe. Comme le laser est incident à travers le bas du substrat, ici le facteur de qualité radiative vers le bas doit être considéré comme \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {P}}}={Q }_{{\rm {r,tot}}}^{{\rm {P}}}\cdot \frac{{S}^{{\rm {P,tot}}}}{{S}^{ {\rm {P,down}}}}\), où \({S}^{{\rm {P,down}}}\) est le flux de rayonnement vers le bas et \({S}^{{\rm {P,tot}}}\) est le flux de rayonnement total.

Le deuxième mécanisme est l'amélioration du taux d'extraction due à une forte modification de la densité spectrale d'états (SDOS) en présence de résonances de Fano. L'émission spectrale et angulaire des QD peut être considérablement modifiée lorsqu'elle est couplée à une résonance de nanostructure macroscopique par rapport à celle de l'espace libre. Comme le montre la figure 2c, des caractéristiques spectrales nettes dans les spectres de fluorescence sont observées. De même, nous définissons le facteur d'amélioration de l'extraction lorsqu'il est couplé à la résonance fluorescente QD comme le rapport entre le taux d'extraction dans le champ lointain en présence de PC (\({\varGamma }^{{\rm {PC}}}\times \frac{{Q}^{{\rm {F}}}}{{Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}}\)) par rapport au taux de espace libre (\({\varGamma }^{{\rm {free}}}\)) :

où \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}\) et QF sont le facteur de qualité radiatif et total du canal fluorescent QD, de manière représentative. Le facteur \({\varGamma }^{{\rm {PC}}}\) a été défini dans une étude précédente45 comme la vitesse à laquelle une collection uniforme et isotrope de molécules génère des photons avec une impulsion cristalline k à la fréquence de résonance ωk. Nous utilisons le facteur de qualité radiative totale au lieu du facteur de qualité radiative descendante car nous allons considérer le rapport de rayonnement descendant plus tard dans le calcul CE.

De plus, la résonance en champ proche est directement corrélée à ses propriétés en champ lointain. Dans le champ lointain, nous avons constaté que la voie de transport PCGR interfère de manière constructive avec la réflexion de fond directe et entraîne un pic de réflexion à la longueur d'onde de résonance. Après inspection du spectre de réflexion du diagramme de bande du PC (Fig. 2f), nous concevons le PC avec un facteur de qualité modéré du mode pompe (\({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm { P}}}=\frac{{\lambda }_{0}}{\varDelta \lambda }\environ 130,19{{{{{\rm{@}}}}}}450\,{{{{{\ rm{nm}}}}}}\)) lorsqu'un incident laser à 9,2 ° correspond à la longueur d'onde d'excitation QD. La Fig. S2 supplémentaire montre le spectre de réflexion PC simulé lorsque le PC est en résonance (étoile vert clair) et hors résonance (point vert foncé) pour le mode pompe à la longueur d'onde d'excitation QD. Le spectre de réflexion PC mesuré expérimentalement est tracé sous forme de points gris superposés avec un QP ≈ 106,41. De même, les spectres d'émission QD sont comparés entre le mode fluorescent couplé au PCGR (vert) et l'émission non couplée (bleu) sur la figure 1c. Avec des facteurs de qualité \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}\approx 225.08\) (simulation conçue) et QF ≈ 115.87 (mesuré expérimentalement) à λQD = 605 nm . De plus, la structure noyau-coque d'un seul QD-605 est clairement résolue (Fig. 1a, encart) à l'aide d'un microscope électronique à transmission (TEM) et le rayon moyen a été mesuré à environ 4 nm (Fig. Supplémentaire S7). En supposant une couche QD de 4 nm d'épaisseur au-dessus de la surface du réseau PC, l'excitation théorique et le facteur d'amélioration sont calculés comme \({\Lambda }_{{{\rm {excitation}}}\approx 21.84\) et \({ \Lambda }_{{{\rm {extraction}}}}\approx 34.39\) (voir partie supplémentaire 4).

Avant que les photons émis par QD ne se couplent avec le mode d'extraction PC et ne fuient vers le champ lointain avec une vitesse de couplage de sortie plus élevée, le processus d'émission spontanée est également modifié (Fig. 1f). En raison de l'amélioration du champ proche et de la densité accrue d'états, les QD placés à la surface du PC connaissent également une amélioration de leur taux d'émission spontanée. Cet effet Purcell améliore l'émission QD en modifiant l'efficacité quantique (QE) sans augmenter le taux de décroissance non radiative en raison de la nature sans perte du matériau diélectrique. L'efficacité quantique améliorée du QD-605 sur PC (QEPC) peut être estimée à l'aide de l'équation suivante :

où γrad,PC, γnonrad,PC et γloss,PC sont les taux radiatif, non radiatif et de perte du QD sur la surface du PC. Nous supposons que le système diélectrique PC ne crée pas de canaux de perte supplémentaires (γloss,PC = 0) et ne modifie pas le taux de décroissance non radiative intrinsèque (γnonrad,PC = γnonrad,i).

Le panneau supérieur de la figure 2d montre la cartographie 2D du facteur d'amélioration Purcell simulé (Fp) en fonction de la position sur la surface du PC. Fp est calculé par le rapport relatif de la modification du taux d'émission spontanée modifiée par rapport au taux d'émission d'origine sur le verre. Sur la base de l'image AFM sur le panneau inférieur, nous alignons la cartographie 2D du facteur Purcell sur la structure topographique de la surface du réseau PC. Lorsque les QD résonnent avec le mode fluorescent PC, les régions de crête fournissent une amélioration Purcell plus élevée que les rainures et atteignent la valeur la plus élevée sur les bords du réseau. Ce système PC diélectrique peut théoriquement améliorer de 3 à 5 fois le taux d'émission spontanée \({\gamma }_{{{\rm {SP}}}}^{{{\rm {PC}}}}\) relative au taux d'émission d'origine \({\gamma}_{{{\rm {SP}}}}^{0}\) sur du verre sans motif.

De plus, la lumière fluorescente améliorée peut se coupler en modes PCGR par interaction en champ proche et être rayonnée vers un espace libre pour être collectée par l'objectif du microscope (Fig. 1d). Le diagramme de bande de dispersion PC (Fig. 2f) dicte comment les photons émis seront redirigés vers l'objectif du microscope dans les directions préférées (efficacité de collecte améliorée). Dans notre système, le PC a été conçu avec précision pour offrir un angle de dispersion pour une émission de 605 nm à 25,8° afin de garantir que l'émission extraite se produit dans une ouverture numérique limitée (30° pour NA = 0,5 objectif).

Le diagramme de rayonnement en champ lointain et l'efficacité de collecte du couplage de sortie QD sont calculés à l'aide de la méthode du domaine temporel à différence finie (FDTD) (voir les parties supplémentaires 6 et 7). Les courbes bleue et rouge de la Fig. 3d présentent la distribution de rayonnement en champ lointain des QD sur les substrats PC et verre, respectivement, dans une représentation polaire. Pour quantifier l'efficacité de collecte améliorée, nous définissons le paramètre \({{\rm {CE}}}=\frac{{S}_{{{\rm {col}}}}}{{S}_{{{ \rm {tot}}}}}\) comme le rapport de la puissance collectée qui entre dans l'objectif du microscope (Scol) à la puissance totale émise par une seule molécule (Stot). Les résultats de simulation (voir la partie supplémentaire 6) suggèrent une amélioration de l'efficacité de collecte (CE) de 3,51 fois de 5,19 % (sur verre) à 18,21 % (sur PC) lors de la collecte des émissions par le bas à l'aide d'un objectif NA = 0,5. Pour examiner la distribution angulaire du diagramme d'émission et sa directionnalité, nous avons imagé la distribution d'émission QD unique au niveau du plan focal arrière (BFP) de l'objectif. Deux encarts sur la Fig. 3d montrent à la fois des enregistrements expérimentaux (barre de couleur bleue) et des simulations numériques (barre de couleur rouge) sous forme de bandes en forme d'hyperbole double. Les points bleus de la figure principale montrent la distribution de puissance normalisée mesurée expérimentalement en fonction à la fois de l'angle de collecte et des limites d'ouverture numérique. La trace rouge sur la Fig. 3d confirme que la simulation numérique concorde remarquablement bien avec les données expérimentales. L'émission QD-605 (FWHM = 28 nm, voir Informations supplémentaires) est principalement confinée dans deux lobes centrés autour de 25,8° avec une largeur à mi-hauteur de distribution angulaire de 9,2°.

a Résultats expérimentaux pour des effets d'excitation améliorés. Image QD unique agrandie dans des conditions PCGR améliorées (à gauche) et non améliorées (à droite) pour le mode pompe uniquement. Le facteur d'amélioration est calculé par \({\Lambda }_{{{\rm {excitation}}},{\exp }}\)= (IE−I0)/I0 après correction de fond, où IE est l'intensité QD unique lorsque le mode pompe PC est en résonance et I0 est l'intensité QD unique lorsque le mode pompe PC est hors résonance. Étant donné que les QD sont toujours à la surface du PC, les améliorations de l'extraction, QY, l'efficacité de la collecte sont les mêmes dans les deux cas. b Résultats expérimentaux pour un taux d'extraction amélioré et des effets d'efficacité quantique (QE). Conditions améliorées (à gauche) et non améliorées (à droite) pour le taux d'extraction amélioré et les effets QE. Angle d'incidence laser : 20°. Résonance du mode pompe désactivée. L'amélioration de l'efficacité de collecte est négligeable lors de l'utilisation de NA = 1,46, objectifs à immersion dans l'huile. c Les mesures TRPL pour les QD d'ensemble ont fait la moyenne du temps de décroissance sur le verre (jaune) et sur le PC (bleu). Les valeurs \({\chi }^{2}\) sont <1,2 pour garantir la qualité de l'ajustement de la courbe. d Images BFP et distribution angulaire de l'émission. Intensité d'émission angulaire théorique (rouge) et mesurée (bleu) pour un seul QD-605 (centre à 604,4 nm avec plage FWHM de 590,4 à 618,4 nm). Encarts : Images théoriques (rouge, NA = 1) et mesurées expérimentalement (bleu, NA = 0,8, dans l'air) du plan focal arrière du QD unique. Les deux lignes pointillées verticales indiquent l'angle de collecte maximal des objectifs (NA = 0,5 et NA = 0,8). e Suppression du clignotement pour les QD couplés au mode PCGR. La trace temporelle (panneau de gauche, bleu), l'histogramme d'intensité de deux états distincts (panneau du milieu, bleu) et les distributions de probabilité de temps marche/arrêt suivent la loi de puissance pour QD sur PC (panneau de droite, bleu). f Clignotant pour les QD sur la surface du verre. La trace temporelle (panneau de gauche, jaune), l'histogramme d'intensité de deux états distincts (panneau du milieu, jaune) et les distributions de probabilité de temps marche/arrêt suivent la loi de puissance pour QD sur PC (panneau de droite, jaune). Temps d'intégration : 100 ms, Objectif : ×100, NA = 1,46, émission d'huile. Puissance laser = 2,1 mW. Mode pompe PC : hors résonance. Les quatre distributions obéissent à une loi de puissance : \({P}_{(t)}\propto {t}^{\alpha }\), où \({\alpha }_{{{\rm {on}}} }\) = −0,98 et \({\alpha }_{{{\rm {off}}}}\) = −1,71 pour QD sur PC. \({\alpha }_{{{\rm {on}}}}\) = −1,63 et \({\alpha }_{{{\rm {off}}}}\) = −0,95 pour QD on verre.

La détection numérique à molécule unique permet non seulement une décision binaire pour chaque signal détectable, mais élargit également la limite de détection des informations quantitatives par un comptage discret pour les analytes à faible concentration (sous-nanomolaires)49. Afin de sonder la capacité de détection d'une seule molécule et les facteurs d'amélioration expérimentaux du microscope à fluorescence améliorée par PC (PCEF), une expérience de balayage de ligne a été réalisée pendant que le PC était éclairé à la condition de résonance. La ligne laser croise un ensemble discret de QD individuels, qui sont clairement observables au-dessus de l'arrière-plan. Plus précisément, le schéma de principe de la configuration de microscopie PCEF est illustré dans la Fig. S3 supplémentaire, où une plaque demi-onde fait tourner la polarisation principale d'une diode laser bleue collimatée (TE, 450 nm, 1–5 mW) orientée perpendiculairement au PC. après passage d'un polariseur linéaire. Focalisé par une lentille cylindrique, le faisceau incident est focalisé sur un profil de ligne (focalisé dans le plan zy tout en étant collimaté dans le plan zx) et s'aligne sur le plan focal arrière (BFP) de l'objectif (×50, NA = 0,5). La sous-figure dans le coin inférieur droit (SI Fig. S3) décrit comment l'angle d'incidence θinc peut être réglé avec précision en déplaçant en translation la ligne de mise au point (déplacement Δx) sur le BFP par transformée de Fourier. Le PC est monté sur une platine d'échantillonnage motorisée et se déplace perpendiculairement à la ligne laser pour effectuer un balayage de ligne. La règle de sélection de l'angle d'incidence à partir de la condition d'adaptation de phase permet une comparaison directe de la distribution du champ proche, de l'intensité d'excitation et de l'émission améliorée QD à la fois dans le résonateur photonique (mode couplé PC-QD) et dans un substrat sans motif (QD solitaire).

Chaque emplacement d'émission limité par la diffraction est ensuite examiné en analysant les fluctuations d'intensité dans le domaine temporel, pour démontrer que l'émission provient d'un seul QD, plutôt que d'agrégats de QD. Nous démontrons que les multi-améliorations du PC sont responsables de l'amplification du signal d'émission QD et que le système fournit des limites de détection à un seul QD grâce à l'observation des signatures d'émission binaires distinctives du clignotement à un seul QD. La figure 1b montre l'imagerie QD à balayage de ligne améliorée sur une surface PC de 120 µm × 120 µm à l'aide du microscope à balayage inversé fait maison avec un angle d'incidence réglé avec précision (précision d'environ 0,025 °) pour le mode PCGR à résonance. Le faisceau incident est focalisé en une ligne (1,5 µm × 0,5 mm) orientée le long de l'axe x sur la surface du PC (perpendiculaire au réseau) et balayant le long de l'axe y. Un test de balayage d'angle automatique est effectué pour déterminer l'angle de résonance exact dans la région de test et pour garantir ainsi l'excitation améliorée sensible à l'angle.

Le facteur d'amplification d'excitation de l'imagerie QD unique a été comparé entre les cas améliorés par PCGR (mode pompe en résonance, Fig. 3a) et non améliorés (mode pompe hors résonance, Fig. 2b, θ = 20 °). Le facteur d'amélioration moyen résolu expérimental de \({\Lambda }_{{{\rm {excitation}}},{\exp }}\approx\) 23,14 (taille d'échantillon de 100 QD individuels) correspond au résultat simulé dans le précédent section. L'encart de la figure 3a montre l'image à contraste amélioré linéaire pour la même image non améliorée en mode pompe. Sans l'amélioration de l'excitation du PC, nous sommes incapables de résoudre clairement tout signal QD sur le bruit de fond relatif en utilisant la même puissance d'excitation (1 mW), l'objectif (NA = 0,5) et le temps d'intégration CCD (0,6 s) utilisés dans notre système. Ces résultats vont au-delà des rapports précédents50, 51, montrant que des points quantiques uniques peuvent être observés à l'aide d'une lentille d'objectif à faible NA (seulement 0,5, contre 1,4 à 1,46 dans les rapports précédents) et d'une microscopie inversée normale avec de multiples améliorations de la surface du PC. Les interactions de liaison à une seule molécule ont été davantage caractérisées en utilisant le phénomène de clignotement QD50, 52,53,54. La trace d'intensité dans le domaine temporel (Fig. 1b) a été enregistrée pour une série d'images recueillies tout en maintenant la ligne laser dans une position fixe avec un temps d'intégration de 100 ms. L'intensité du pixel est calculée par la valeur moyenne (données brutes 16 bits) d'un seul point lumineux limité par la diffraction. Deux états d'intensité distincts (IQD et IB) peuvent être clairement distingués en raison de l'intermittence d'émission et correspondent à l'intensité QD intrinsèque et au fond global. Nous attribuons l'écart significatif entre le signal QD et le bruit de fond à l'extraordinaire amélioration du rapport signal sur bruit (SNR = \(\frac{\left|{I}_{{{\rm {QD}}}}-{I} _{{\rm {B}}}\right|}{{\sigma }_{{{\rm {noise}}}}}\), augmenté de <1 à 59,31) offert par l'amélioration de la surface du PC.

Étant donné que les améliorations du taux d'extraction et de l'efficacité quantique sont toujours présentes pour un QD situé sur la surface du PC, nous sondons les facteurs d'amélioration expérimentaux (\({\Lambda }_{{{\rm {extraction}}},{\exp } }\) et \({\eta }_{{{\rm {QE}}}}=\frac{{{{\rm {QE}}}}_{{{\rm {pc}}}}} {{{{\rm {QE}}}}_{0}}\)) en comparant l'imagerie à un seul QD lorsque le QD est sur le PC (lorsque le mode pompe est hors résonance) et sur une surface en verre. Une plus grande NA (1,46, immersion dans l'huile, × 100, Zeiss α Plan-APO-CHROMAT) et une puissance d'entrée laser plus élevée (2,1 mW) sont utilisées afin d'observer des points quantiques uniques sur la surface du verre. La figure 3b montre la comparaison entre la différence d'émission QD unique obtenue à partir d'une extraction améliorée et d'un QY amélioré lorsque des QD simples sur PC (à gauche) et sur verre (à droite). Ici, le laser était incident à un angle de 20° (hors résonance pour le mode pompe) pour éliminer les effets d'excitation améliorés du PC. L'amélioration de l'efficacité de la collecte est négligeable lors de l'utilisation de l'objectif NA élevé. Ainsi, le facteur d'extraction améliorée et QY est mesuré par \(\scriptstyle{\Lambda }_{{{\rm {extraction}}},{\exp }}\cdot {\eta }_{{{\rm { QE}}}}=\frac{{I}_{{{\rm {QD}}}}^{{{\rm {PC}}}}-{I}_{{{\rm {QD}} }}^{{{\rm {Verre}}}}}{{I}_{{{\rm {QD}}}}^{{{\rm {Verre}}}}}\) après correction de l'arrière-plan. Le facteur moyen d'amélioration de l'extraction d'environ 38,63 a été calculé sur la base d'un échantillon de 100 QD individuels, ce qui est comparable aux données de simulation susmentionnées.

Semblable à la simulation numérique, notre mesure de photoluminescence résolue dans le temps (TRPL) indique un facteur Purcell expérimental d'environ 3,11 pour les QD d'ensemble sur la surface du PC par rapport au verre. Montré sur la Fig. 3c, le temps de décroissance moyen de τglass = 5,32 ns (± 0,24 ns) tandis que le τpc = 1,71 ns (± 0,31 ns). Le taux d'émission calculé dépend de la position latérale du QD sur la surface du PC et reste constant pour une large plage de longueurs d'onde (500 à 700 nm) d'émetteurs fluorescents uniques (voir Fig. S6 supplémentaire). L'efficacité quantique intrinsèque (QEi = 40,84%) pour QD-605 sur des lames de verre obtenues dans (Partie supplémentaire 9 et Fig. S5) a été utilisée pour déterminer le rapport du taux de décroissance intrinsèque non radiatif et radiatif (\({\gamma }_{{{\rm {non}-{rad},i}}}/{\gamma }_{{{\rm {rad},i}}}=0,4084\)). En utilisant l'éq. (3) et le facteur d'amélioration de Purcell moyen résolu expérimental \(({\gamma }_{{{\rm {rad},{PC}}}}/{\gamma }_{{{\rm {rad},i }}}=3,11)\), nous pouvons estimer le \({{{{{{\rm{QE}}}}}}}_{{{\rm {PC}}}}\) à 68,22 % et le facteur d'amélioration QE \(({{\eta }_{{{\rm {QE}}}}={{\rm {QE}}}}_{{{\rm {PC}}}}/{ {{\rm {QE}}}_{{\rm {i}}})\) à 1,67.

La densité locale des états de photons disponibles est augmentée dans le système couplé QD-PC par rapport à un QD solitaire. Cela accélère la décroissance radiative à laquelle un état excité QD passera à l'état fondamental avec une durée de vie réduite (taux de décroissance plus rapide) et émet des photons spontanément. Le taux plus élevé de ce processus de désintégration radiative concurrence favorablement les autres voies de désintégration non radiatives par lesquelles un électron est perdu par recombinaison Auger et/ou piégeage de surface, ce qui entraîne des états désactivés55, 56, supprimant ainsi le clignotement. La figure 2h montre la suppression du clignotement pour un QD couplé au mode PCGR. Le seuil est défini comme le double du niveau de fond moyen. Nous calculons que la fraction des temps de fonctionnement est de 87,21 % sur PC et de 14,49 % sur le verre. Des valeurs similaires ont été obtenues lors de la définition du seuil comme le minimum entre les deux pics distincts des états marche et arrêt. Les probabilités des périodes d'activation et de désactivation pour un QD sur PC (bleu) et sur verre (jaune) ont été ajustées à une distribution de loi de puissance de la forme, comme le montre la Fig. 3f, le paramètre de puissance pour le temps "on" , αon = −1,63, pour QD sur la vitrine, tandis que le paramètre "off", αoff = −0,95. Pour le QD sur PC (Fig. 3e), les paramètres de probabilité d'activation et de désactivation étaient αon = -0, 98, αoff = -1, 71, montrant une probabilité accrue d'événements activés et une probabilité réduite d'événements désactivés.

Après avoir démontré la capacité de recueillir des images signal/bruit élevées de QD uniques immobilisés sur une surface de PC, nous avons ensuite cherché à utiliser les QD comme étiquettes biomoléculaires pour un test de miARN sans enzyme, dans lequel chaque molécule de miARN cible dans l'échantillon de test peut entraîner la fixation d'une étiquette QD à la surface du PC. Nous appelons ce type de détection une résolution numérique car chaque QD peut être compté pour donner une mesure quantitative directe qui ne nécessite pas d'amplification enzymatique des molécules cibles, dans laquelle les molécules cibles à faible concentration devraient entraîner des marqueurs qui sont distribués à faible densité sur la surface de détection. De plus, nous souhaitons une approche de biologie moléculaire hautement sélective pour la séquence de miARN cible, ce qui entraînera la non-capture des étiquettes QD pour les séquences non cibles.

Suite à des travaux récents associant les niveaux de miR-375 dans le sérum humain aux métastases du cancer de la prostate, à l'agressivité et au pronostic de survie57,58,59,60, nous avons sélectionné ce biomarqueur comme cible initiale pour caractériser les capacités de notre plateforme de détection. Sur la figure 1a, le PC a été utilisé comme substrat de biocapteur pour un test activé par pont dans lequel les côtés opposés de la molécule cible de miARN se lient à des séquences d'acide nucléique simple brin complémentaires immobilisées sur le QD et sur le PC. Ainsi, deux interactions de liaison d'acide nucléique à haute spécificité doivent se produire pour qu'un QD établisse une forte fixation de surface au PC, et la molécule cible de miARN sert de pont biomoléculaire entre le QD et le PC (Fig. 4a).

a Dans le processus de dosage activé par pont, les QD-tags seront tirés vers la surface du PC lorsque les miARN cibles pontent la formation d'un complexe lié à la surface. b Illustration du processus de balayage de ligne qui compte le nombre de QD connectés au PC. c Imagerie à balayage linéaire : pour le comptage numérique amélioré PCEF dans le sérum humain. Concentration cible : 10 aM à 1 nM. Champ de vision : 300 µm × 300 µm. Barre d'échelle : 40 µm. Les données sont des moyennes de plus de 9 FOV, et les barres d'erreur indiquent l'écart type entre trois répliques indépendantes. La signification statistique a été testée en utilisant une ANOVA unidirectionnelle entre le groupe témoin négatif et tous les groupes de test avec P < 0,0001 ; Conditions d'imagerie pour le test sur le PC : puissance laser = 1 mW, gain EM = 40 × ; Une puissance laser plus élevée (5 mW) et un gain EM (1200×) sont nécessaires pour détecter le changement d'intensité à 1–22 h sur le verre tout en évitant la saturation du signal à 1 nM ; Le même temps d'intégration (600 ms) et les mêmes objectifs (× 50, NA = 0, 5) ont été appliqués dans les deux essais de surface. d Courbe dose-réponse pour diverses concentrations sur une plage de concentration de 109 fois après une incubation de 2 h pour les résultats de comptage numérique. Les barres d'erreur représentent la moyenne et l'écart type de n = 3 essais indépendants. e Test de discrimination des mésappariements à base unique. Le panneau d'image à balayage linéaire montre la résolution numérique des QD capturés pour le groupe de correspondance parfaite (PM) miR375 cible, par rapport à trois SNV différents à 100 pM. f Quantification de la séquence cible de correspondance parfaite et des cas de SNV à une concentration de 100 pM. La signification statistique a été testée à l'aide de tests t indépendants (bilatéraux) ; ****P < 0,0001. Les barres d'erreur représentent la moyenne et l'écart type de n = 3 essais indépendants.

Le PC a été initialement préparé par dépôt par évaporation d'une couche uniforme d'époxy-silane. Avant la silanisation, la surface supérieure du PC a été traitée avec un plasma de surface à l'oxygène pendant 10 min afin d'activer la surface en créant une densité de groupes -OH ainsi qu'en éliminant la contamination organique. Les sondes d'ADN spécifiques à miR et les oligos cibles présentés ont été conçus à l'aide de NUPACK61 (voir la partie supplémentaire 15). La séquence de sonde d'acide nucléique de capture pull-down (jaune) est un ADN simple brin (ssDNA) avec une modification NH2- (groupe radical aminé) à l'extrémité 5' pour une fixation covalente à la couche de silanisation pour la fonctionnalisation de surface PC. Les sondes ssDNA (bleues) sont conjuguées avec des QD-tags (68 nM) par une interaction biotine-streptavidine et purifiées par filtration répétée. De plus, nous concevons des sondes d'ADNss étiquetées QD et des séquences de capture avec des lieurs oligo(T) à 5 bases comme espaceurs pour éviter les effets stériques entre les surfaces QD et PC.

La cible de détection miR-375 (rose) comprend 22 nucléobases, où l'extrémité 5' (10 bases) est complémentaire de la séquence de capture sur la surface du PC (jaune), et l'extrémité 3' (12 bases) est complémentaire du QD -séquence de la sonde ssDNA (bleu). La nature complémentaire de cette structure de paires de bases permet au miARN cible d'agir comme un pont qui stabilise la connexion entre la capture et la sonde QD-ssDNA en formant un duplex ADN-ARN. Sans le pont - le miARN cible - les étiquettes fluorescentes (sonde QD-ssDNA) ne seront pas attirées vers la surface du PC et ne connaîtront donc pas l'amélioration de 3000 × susmentionnée, même si elles sont éclairées par le laser d'excitation (Fig. 4b). Suivant les directives récentes en matière de conception de sondes d'hybridation spécifiques et robustes, nous avons optimisé l'énergie de réaction de Gibbs entre la sonde d'ADN et la cible pour qu'elle soit approximativement nulle (ΔG' ~ 0)62. À ΔG' ~ 0, la pénalité énergétique moyenne d'un seul mésappariement est supérieure (ΔΔG) au gain d'énergie libre de l'appariement parfait, limitant ainsi la liaison hors cible avec une spécificité quasi optimale et fournissant des rendements d'hybridation de 99,2 % (à 23 °C, Na+ : 1 mM). NUPACK a été utilisé pour simuler les propriétés d'appariement de bases à l'équilibre en termes de structure secondaire d'acide nucléique et d'énergie libre. Le nombre d'acides nucléiques de la capture et de la sonde d'ADNsb a été soigneusement choisi pour minimiser la formation de structure secondaire indésirable. Par exemple, si le nombre de bases de la séquence de capture passe de 10 à 12, les oligos de capture forment une structure en épingle à cheveux et n'ont pas la capacité de s'apparier avec la partie inférieure du miARN cible.

Étant donné que le PC améliore exclusivement les sondes marquées QD à proximité de la surface grâce à l'amélioration du champ évanescent et à l'extraction guidée améliorée, la microscopie améliorée PCGR fournit une coupe en z de type TIRF qui permet de compter uniquement les balises QD à moins de 60 nm de la surface. . Par conséquent, seuls les QD tirés vers le bas seront améliorés et signaleront un signal positif pour les événements de liaison individuels ; tandis que les QD libres non liés ne seront pas comptés puisque le single non amélioré est comparable au bruit de fond. De plus, la surface du PC et la surface du QD sont anioniques, liées par des séquences d'ADNss et ont tendance à se repousser électrostatiquement pour empêcher l'adhésion non spécifique des QD à la surface du PC. Le test en 2 étapes susmentionné a été effectué en incubant séquentiellement une concentration définie de miR-375 (4 h), puis en ajoutant une quantité constante de sondes ssDNA-QD (2 h) dans un puits de polydiméthylsiloxane collé au PC (~ 45 μL par puits ). Chaque étape d'incubation est accompagnée d'étapes de lavage doux pour éliminer les cibles libres et les QD-tags non liés.

Les tests de capture de surface conventionnels peuvent mesurer des analytes marqués par fluorescence sur une plage de concentration de 1000 fois et au niveau sous-nanomolaire, mais de nombreuses molécules biologiques présentent des variations d'abondance de plus de 1 000 000 fois jusqu'au niveau sous-femtomolaire. Les tests basés sur l'amplification par PCR numérique peuvent offrir une quantification absolue de l'acide nucléique avec une plage dynamique améliorée jusqu'à cinq ordres de grandeur63,64,65 en utilisant un contrôle précis du cycle thermique. Sans amplification enzymatique, nos recherches précédentes66 combinaient le comptage d'une seule molécule et l'étalonnage de l'intensité montrant que la plage dynamique des tests de fluorescence peut être étendue à une plage similaire (105 fois) et atteindre une limite de détection d'environ 10 fM à l'aide d'un microscope TIRF avec un NA = 1,46 , objectif ×100 et EMCCD à gain élevé. En fin de compte, nous démontrons que la multi-amélioration du test PC-QD peut fournir une biodétection à résolution numérique sans enzyme pour le comptage direct d'un seul miARN avec une optique peu coûteuse (NA = 0,5 objectif, diode laser à faible puissance et CCD à faible gain EM). La capacité de comptage direct produit des caractéristiques dose-réponse linéaires lorsqu'elles sont tracées sur une échelle log-log sur une plage de concentration cible de 10 aM à 1 nM avec une amélioration de la limite de détection de 10 000 × par rapport à la mesure d'intensité d'ensemble analogique.

Les miARN circulants sont très stables dans le sérum humain67, et la détection directe de miR-375 dans le sérum s'est récemment révélée possible68. Pour démontrer la faisabilité de notre détection numérique basée sur QD dans une matrice d'échantillon natif non traité, nous avons dopé des cibles miR-375 dans du sérum humain (Sigma-Aldrich, H3667) à 12 concentrations finales allant de 100 zM à 10 nM, puis effectué les tests de détection sans effectuer d'extraction ou de purification d'ARN. La figure 4c, d montre les résultats de comptage de la résolution numérique améliorée par PC par rapport aux mesures d'intensité analogiques conventionnelles d'un test basé sur la surface de verre (SI Fig. S14). Les résultats de balayage de ligne sont des représentations sélectionnées du test susmentionné pour des concentrations spécifiques de miARN cible dans une solution tamponnée. Le microscope à balayage linéaire a été programmé pour acquérir la lumière d'émission QD de chaque pixel dans le champ de vision (FOV) pour le comptage des balises QD ou l'enregistrement de l'intensité moyenne. Pour chaque puits de test, nous avons scanné la surface totale avec le FOV = 1 mm × 1 mm et l'avons divisée en 9 à 11 petites régions (sous-FOV = 300 µm × 300 µm). Afin d'obtenir des valeurs représentatives, le décompte rapporté pour chaque groupe est la moyenne des 9 à 11 sous-FOV. Plusieurs algorithmes d'analyse d'imagerie ont été utilisés, notamment le seuillage local de Bradley69, l'amélioration adaptative du contraste70 et l'identification des particules en fonction de la taille. La figure 4d montre le nombre de QD capturé après 2 h d'incubation de l'échantillon de test avec le PC (à l'équilibre de liaison) en fonction de la concentration miR diluée en série, avec 10 aM et 1 nM représentant les concentrations les plus basses (à l'exclusion de miR) et les plus élevées. mesurés, respectivement. Les barres d'erreur illustrées à la Fig. 4d représentent l'écart type obtenu à partir de trois répétitions biologiques dans un compartiment liquide individuel. Trois expériences indépendantes en double aveugle ont été réalisées pendant l'étiquetage de la concentration cible, l'incubation du test et le comptage des particules pour éviter la cueillette des cerises et minimiser d'autres facteurs anthropiques. Comme prévu, une liaison de fond QD négligeable a été observée avec 0 M de miARN-375 (groupe de référence sur la figure 4c) sur toute la durée de l'imagerie. Avec une différence de comptage significative entre 3 fois l'écart type à 0 M, une limite de détection (LOD) de 10 aM est démontrée. Une réduction supplémentaire de la concentration cible (1 aM et 100 zM) conduit à des résultats de comptage au même niveau du signal de fond car la disponibilité de la cible capturée en surface est maintenant limitée par le volume de l'échantillon (voir SI partie 15). Sans le comptage de cible unique assisté par PC, les mesures d'intensité analogiques conventionnelles nécessitent une puissance incidente laser plus élevée (5 mW) et le réglage de gain EM le plus élevé (1200 ×) de la caméra CCD pour atteindre un LOD de 1 à 10 pM (SI Fig. .S16).

Afin de démontrer la sélectivité du test, nous avons simulé la variation de mésappariement d'une seule base (variants à un seul nucléotide, SNV) pour les 22 positions le long de la cible miR-375 à l'aide de NUPACK. Les résultats (SI, Fig. S17) montrent que notre essai de pont est sélectif contre la variation à base unique sur l'indice de position 4-8 (compté à partir de l'extrémité 5 '), où cette mutation spécifique se trouve aurait une signification clinique71. Les figures 4e, f illustrent une diminution spectaculaire du comptage des particules, résultant des SNV aux indices #4, #6 et #8, avec une plage de réduction du signal de 90 à 92 % (différence dans les résultats de comptage : \(\triangle N=\ frac{{N}_{{{\rm {PM}}}}-{N}_{{{\rm {MM}}}}}{{N}_{{{\rm {PM}}}} }\) = 90–92 %, avec des valeurs P bilatérales < 0,0001) par rapport au groupe d'appariement parfait (PM) à 2 h.

En plus de sonder la valeur du point final lorsque la réaction de fixation du pont atteint l'équilibre, nous avons également comparé l'interaction transitoire entre le QD et la surface du PC en analysant les caractéristiques dynamiques des trajectoires de mouvement des QD qui échantillonnent la surface du PC pendant le processus. de reliure. Afin d'augmenter l'énergie libre globale du système et de prolonger la durée d'interaction, nous avons réduit le rapport de la sonde ssDNA par QD de 10:1 à 5:1. Nous lançons l'enregistrement des séquences d'images de fluorescence immédiatement après l'ajout des sondes QD fonctionnalisées par l'ADNsb. En commençant par une surface vierge, nous avons observé l'émission QD dans notre champ de vision d'imagerie après environ 10 min d'incubation avec l'échantillon de test. Un algorithme de suivi d'une seule particule a été mis en œuvre à l'aide du logiciel MATLAB u-track72, et chaque trajectoire de particule a été analysée pour la diffusion. Nous avons observé des trajectoires distinctes de QD en contact avec la surface et sélectionné deux images représentatives, comme le montre SI Fig. S15, pour démontrer leur empreinte digitale unique causée par la discrimination de liaison. Nous émettons l'hypothèse que la manipulation de la constante de dissociation de l'interaction miARN-ADNsb pour le test de pont entraînera une variabilité dans le chemin de diffusion localisé en surface. Suivant la méthode standard de suivi d'une seule nanoparticule, nous avons ensuite analysé les trajectoires en calculant le déplacement quadratique moyen dépendant du temps (MSD). Les trajectoires résultantes sont généralement analysées pour leur type de comportement motionnel car le mouvement fournit des informations sur les interactions entre la particule (sonde QD) et son environnement (différents substrats cibles). Cinq tracés MSD linéaires (vert) dans SI Fig. S15 indiquent une diffusion normale lorsque le substrat cible présente un décalage à une seule base et peut être décrit par r2 ∝ Dτ (r2 : déplacement de diffusion, D : le coefficient de diffusion et τ : intervalle de temps ). Inversement, le MSD du groupe de correspondance parfaite (bleu) s'approche asymptotiquement d'une valeur maximale pour un τ plus grand, indiquant que la sonde QD subit une diffusion confinée ou corrallée avec une relation r2 ∝ 1−e−Dτ.

En utilisant des améliorations PC à la fois dans l'excitation QD en champ proche et le couplage de sortie guidé par dispersion en champ lointain, nous avons développé une plate-forme de biocapteur photonique simple qui fournit une amplification de l'émission QD jusqu'à 3000 fois. Nous avons pu résoudre des QD uniques même avec une faible ouverture numérique de 0,5, permettant une configuration optique peu coûteuse pour fournir une résolution numérique de molécules cibles individuelles pour une détection de miARN attomolaire hautement spécifique, dynamique, rapide et cliniquement pertinente. Notre plate-forme d'imagerie PC-QD ne nécessite pas un gain élevé d'une caméra EMCCD (×40, seulement 1/30 du gain EM maximal sur la caméra) et réduit encore le coût et la complexité de l'instrument.

Le test de pont a été effectué à température ambiante sans amplificon cible enzymatique, ce qui représente un flux de travail simple par rapport à la qRT-PCR. La petite masse des marqueurs QD sert à réduire les précipitations dues à la gravité, ce qui entraîne un faible nombre de bruits de fond (à cause de la liaison ou de l'adsorption non spécifique)73. La pré-incubation de la capture de cible a permis de s'assurer que chaque QD attaché à la surface ne contient qu'une seule molécule cible, et donc de fournir une courbe dose-réponse linéaire corrélée à la plage étendue de concentration d'analyte (0,01 fM - 1 nM) et ainsi faciliter la quantification sans la nécessité d'une correction post-détection par analyse statistique de Poisson74. Nous observons un graphique dose-réponse linéaire lorsque nos données sont tracées sur une échelle log-log (Fig. 4b). Le comportement observé est le résultat de plusieurs facteurs qui comprennent : (a) la diffusion limitée75 des miARN à la surface du biocapteur, où ils peuvent être capturés, en particulier à des concentrations plus faibles et (b) l'encombrement stérique et la saturation de surface, où la fraction des sites de liaison disponibles sur la surface du PC est réduite à des concentrations élevées, ce qui rend plus difficile la liaison des miARN nouvellement arrivés76, 77. Il est important de noter que le graphique dose-réponse (Fig. 4b) ne montre aucun chevauchement significatif entre les concentrations adjacentes basées sur sur les valeurs d'écart type pour trois mesures indépendantes à chaque concentration. Ainsi, l'approche de détection de résolution numérique présentée dans notre travail ne nécessite pas de correction de Poisson, comme cela est nécessaire pour des approches telles que ddPCR et Quanterix Simoa™, où plusieurs molécules cibles sont confinées dans le même volume de nanogouttelettes sont amplifiées ensemble tout en ne produisant qu'un seul événement positif. .

Les variantes mononucléotidiques (SNV) peuvent être discriminées dans le comptage statique après 2 h avec une réduction de signal détectée spatiale élevée. Dans une étape supplémentaire, nous avons sondé l'interaction cinétique et transitoire d'hybridation ADN en utilisant une analyse de trajectoire dynamique de QD uniques et avons démontré la capacité de discriminer les SNV en 10 min sans lavage, ce qui peut offrir une autre voie pour différencier si les étiquettes individuelles sont liées spécifiquement ou non spécifiquement. Fait intéressant, avec les effets d'amélioration combinés, nous pouvons observer la saturation QD et la génération de multiexcitons lorsque la puissance laser d'entrée est supérieure à 3 mW dans des conditions de résonance PC à température ambiante (Fig. S7 supplémentaire).

Notre plate-forme d'émission QD améliorée par PC n'est pas strictement limitée à une seule longueur d'onde. En concevant le chevauchement spectral et les propriétés de dispersion des divers modes de fuite pris en charge par les PC, on peut étendre l'effet d'amélioration à une large gamme d'espèces fluorescentes qui utilisent la même longueur d'onde d'excitation (par exemple, QD-525, QD-565, QD -585, QD-625, QD655, QD685). Bien que ce ne soit pas l'objet de ce rapport, nous prévoyons que l'approche décrite ici peut être facilement multiplexée grâce à l'utilisation future d'étiquettes QD avec des spectres d'émission distincts, dans lesquels chaque couleur QD peut représenter un test pour une séquence cible de miARN différente dans le même échantillon de test. . Dans les travaux futurs, nous combinerons plusieurs séquences de miARN cibles avec des séquences d'ADN de capture co-immobilisées distinctes pour permettre le multiplexage dans une seule région de test.

La fabrication du PC a commencé à partir du dépôt ultérieur d'une couche d'arrêt de gravure Al2O3 de 10 nm d'épaisseur et d'un film mince de SiO2 de 130 nm sur un substrat en verre de 200 mm de diamètre (Corning, verre de qualité d'affichage Eagle XG de 0,7 mm). Les structures de réseau de sous-longueur d'onde ont ensuite été modelées par une lithographie ultraviolette profonde (DUV) de grande surface suivie d'une gravure sèche réalisée par une fonderie (Moxtek, Inc. Orem, UT). La plaquette a ensuite été découpée en petits morceaux (1,2 cm x 2,5 cm). Un film Si3N4 à indice de réfraction élevé (~ 115 nm) et un mince revêtement biocompatible TiO2 (~ 5 nm) ont été déposés sur le substrat à motifs à l'aide d'un pulvérisateur (Kurt J. Lesker PVD 75) (voir Supplémentaire pour les détails de caractérisation).

Nous avons utilisé un microscope à focalisation linéaire construit à la maison (Fig. 3 supplémentaire) pour exciter le système PC – QD et sonder l'intensité de fluorescence, le spectre d'émission et les résultats de balayage des dosages de miARN. Une diode laser de 450 nm (OSRAM, PL450B) sert de source de lumière d'excitation. Les signaux fluorescents sont imagés par un spectromètre d'imagerie (Horiba iHR 550) avec une caméra à dispositif à couplage de charge multiplicateur d'électrons (EM-CCD) (Hamamatsu, C9100-13). Toutes les images de numérisation d'essai sur PC et les tests de facteur d'amélioration d'excitation sont effectués à l'aide d'une lentille à faible NA × 50 et d'une faible puissance laser (Olympus LMPLFLN × 50, NA = 0, 5; puissance laser = 1 mW). Étant donné que les QD simples ne sont pas capables de se résoudre sur le verre à l'aide d'une lentille à faible NA, les tests de facteur d'amélioration de l'extraction et les expériences de comparaison de clignotement sont effectués à l'aide d'une lentille à haute NA × 100 et d'une puissance laser plus élevée (Zeiss alpha Plan-APO × 100 Oicl DIC, NA = 1,46 ; puissance laser = 2,1 mW). Des images expérimentales du plan focal arrière ont été prises à l'aide d'un objectif de Bertrand (longueurs focales de 180 mm) et d'objectifs Olympus × 100 (LMPLFLN × 100, NA = 0, 8).

La caractérisation en champ lointain résolue en angle du PC nu a été réalisée pour démontrer les facteurs de qualité permettant de calculer les effets d'amélioration estimés. L'échantillon a été recouvert d'eau et monté sur un rotor motorisé avec son axe y aligné sur l'axe de rotation. Un faisceau collimaté (surface ~ 5 mm2) de lumière blanche provenant d'une lampe Deutérium-Halogène passe à travers un polariseur linéaire (polarisation TE) et frappe l'échantillon à l'angle d'incidence θ. La lumière réfléchie d'ordre zéro à une série d'angles d'incidence a été collectée à l'aide de fibres optiques et envoyée au spectromètre (Ocean Optics 20000). Le spectre d'émission découplé du système PC-QD a été collecté à un angle θcol = 26° focalisé par une lentille sur la fente du spectromètre (Acton Research, SpectraPro 500i) avec une caméra CCD (Princeton Instruments, PIXIS)

La photoluminescence résolue dans le temps (TRPL) a été mesurée à partir de QD d'ensemble à l'aide d'une configuration personnalisée (Fig. S4 supplémentaire). La source d'excitation était un laser Ti: saphir (Spectra-Physics Mai Tai) avec un oscillateur paramétrique optique, produisant des impulsions de 100 à 120 fs à λlaser = 425 nm et un taux de répétition de 80 MHz. L'excitation était hors résonance du mode pompe PC (θin = 26°) avec une puissance de 2,1 mW. L'émission a été collectée à un angle de couplage de sortie QD (θcol = 26 °) et passée à travers des filtres passe-long de 550 nm pour éliminer le laser d'excitation et imagée sur des photodiodes à avalanche à photon unique en silicium (Si-SP-APD). Les APD ont été connectés à un module de comptage de photons uniques corrélé dans le temps, qui a assemblé un mode d'étiquette de paramètre à photon unique et des modes de distribution de photons pour générer l'histogramme des temps d'arrivée des photons. La résolution temporelle du système était d'environ 22 ps.

Toutes les mesures ont été effectuées à une puissance incidente moyenne sur le PC de 1 à 2,1 mW. Sur la base de la dépendance de l'intensité émise en fonction de la puissance d'excitation, nous concluons que les mesures de tous les échantillons ont été effectuées dans le régime linéaire (non saturé) (Fig. S7 supplémentaire).

Les images de microscopie électronique à transmission (TEM) des QD ont été collectées à l'aide du JEOL 2100 Cryo TEM fonctionnant à 200 kV. Des images de microscopie électronique à balayage (SEM) de l'échantillon PC – QD ont été obtenues à l'aide d'un SEM à émission de champ Hitachi S-4800. Une fine couche conductrice (~ 6 nm, or-palladium pour la vue à vol d'oiseau et carbone pour la vue en coupe) a été pulvérisée sur l'échantillon avant SEM.

Les profils de hauteur en coupe transversale du PC ont été analysés avec un microscope à force atomique (AFM) (Cypher, Asylum Research) en mode contact à l'aide d'une pointe en silicium monolithique avec un revêtement réflexe en aluminium de 30 nm d'épaisseur (Budget Sensors).

Les puces PC ont été soniquées dans de l'acétone (Sigma-Aldrich), de l'alcool isopropylique (Sigma-Aldrich) et de l'eau désionisée respectivement pendant 2 min et séchées sous un courant d'azote comprimé, suivies d'un traitement au plasma d'oxygène de 200 W à une pression de 500 mTorr pendant 10 min en utilisant un système Pico Plasma (Diener electronic, Allemagne). Dans une chambre de réaction en verre, du (3-glycidoxypropyl) triméthoxysilane (GLYMO, Gelest, Morrisville, PA, USA) a été déposé en phase vapeur sur la surface du PC dans un four à vide à une température de 80 ° C sous 30 Torr pendant 4 à 5 h . Pour chaque puce PC en dépôt en phase vapeur, 100 μL de GLYMO ont été ajoutés à la chambre de réaction en verre contenant. Les puces PC déposées ont été retirées du four et soniquées dans du toluène (Sigma-Aldrich), du méthanol (Sigma-Aldrich) et de l'eau déionisée, respectivement, pendant 2 minutes, et séchées à l'azote. Pour la fonctionnalisation de l'ADN d'une surface de PC de 1,25 cm2, un volume de 40 μL, 50 μM d'oligo de capture de PC à terminaison amino (tampon 1 × TE, 0,05% TWEEN-20, pH = 9,0), et distribué sur le PC déposé GLYMO surface. Après 6 h d'incubation à température ambiante, les puces PC ont été rincées par une diminution progressive de la concentration du tampon TE de 1× à 0,01×. Un tampon de blocage (SuperBlock TBS, Thermo Fisher Scientific) a été ajouté pendant 20 min et lavé deux fois avec du tampon TE 1X avant utilisation.

Les QD605 revêtus de streptavidine (SA) (Invitrogen) ont été séparés du surnageant après 3 min de centrifugation à 5000 × g. Les sondes ssDNA et le QD605 revêtu de streptavidine (SA) (Invitrogen) sont conjugués au rapport de stoechiométrie de 10: 1 (Sonde: QDs) dans un tampon 1 × TE et incubés pendant 2 h à température ambiante tout en mélangeant doucement dans un rotateur pour assurer suffisamment réaction. Le conjugué a ensuite été filtré en utilisant un filtre Amicon de 0,5 ml (MWCO 50 kDa) pour éliminer les sondes d'ADN libres de la solution. La concentration finale de QD est d'environ 68 nM.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données qui appuient les conclusions de cette étude sont disponibles dans l'article et ses informations supplémentaires, ou auprès de l'auteur correspondant sur demande.

Ganesh, N. et al. Émission de fluorescence améliorée à partir de points quantiques sur une surface de cristal photonique. Nat. Nanotechnologie. 2, 515-520 (2007).

Article ADS PubMed Google Scholar

Race, CM et al. Un Dosage Microfluidique Automatisé Pour La Détection Améliorée Par Cristal Photonique Et L'analyse D'un Antiviral Anticorps Cancer Biomarker in Serum. Journal des capteurs IEEE. 18, 1464-1473 https://doi.org/10.1109/JSEN.2017.2777529 (2018).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Mathias, PC, Ganesh, N. & Cunningham, BT Application de la fluorescence améliorée par cristal photonique à un immunodosage de cytokines. Anal. Chim. 80, 9013–9020 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Pokhriyal, A. et al. Fluorescence améliorée par cristal photonique à l'aide d'un substrat de quartz pour réduire les limites de détection. Opter. Express 18, 24793–24808 (2010).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bauch, M., Toma, K., Toma, M., Zhang, Q. & Dostalek, J. Biocapteurs à fluorescence améliorés par plasmon : une revue. Plasmonics 9, 781–799 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liebermann, T. & Knoll, W. Spectroscopie de fluorescence améliorée par champ de plasmon de surface. Colloïdes Surf. A : Physicochem. Ing. Aspic. 171, 115–130 (2000).

Article CAS Google Scholar

Dong, L. et al. Comparaison de quatre plates-formes PCR numériques pour une quantification précise du nombre de copies d'ADN d'un matériau de référence d'ADN plasmidique certifié. Sci. Rep. 5, 13174 (2015).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kulkarni, MM Analyse de l'expression génique multiplexée numérique à l'aide du système NanoString nCounter. Courant. Protocole Mol. Biol. 94, 25B.10.21–25B.10.17 (2011).

Google Scholar

Rissin, DM et al. Le test immuno-enzymatique à molécule unique détecte les protéines sériques à des concentrations subfemtomolaires. Nat. Biotechnol. 28, 595–599 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bolger, AM, Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic : un trimmer flexible pour les données de séquence Illumina. Bioinformatique 30, 2114–2120 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vu, TQ, Lam, WY, Hatch, EW & Lidke, DS Points quantiques pour l'imagerie quantitative : des molécules uniques aux tissus. Tissu cellulaire Res. 360, 71–86 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le, P. et al. Compter les facteurs de croissance dans des cellules individuelles avec des points quantiques infrarouges pour mesurer les distributions de stimulation discrètes. Nat. Commun. 10, 909 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kinkhabwala, A. et al. Grandes améliorations de la fluorescence d'une seule molécule produites par une nanoantenne en nœud papillon. Nat. Photonics 3, 654–657 (2009).

Article ADS CAS Google Scholar

Punj, D. et al. Antennes dimères de nanoparticules auto-assemblées pour la détection de fluorescence d'une seule molécule améliorée par plasmonique à des concentrations micromolaires. ACS Photonics 2, 1099-1107 (2015).

Article CAS Google Scholar

Zhang, T., Gao, N., Li, S., Lang, MJ et Xu, Q.-H. Étude spectroscopique à une seule particule sur l'amélioration de la fluorescence par des dimères de nanotiges d'or couplés au plasmon assemblés sur de l'origami d'ADN. J.Phys. Chim. Lett. 6, 2043-2049 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Akselrod, GM et al. Sonder les mécanismes d'amplification de Purcell à grande échelle dans les nanoantennes plasmoniques. Nat. Photonique 8, 835–840 (2014).

Article ADS CAS Google Scholar

Luan, J. et al. Marqueurs nanométriques fluorescents ultra-brillants pour la détection femtomolaire d'analytes avec des tests biologiques standard. Nat. Biomédical. Ing. 4, 518–530 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bhaskar, S. et al. Ingénierie supérieure des nanocavités résonnantes sur la plate-forme d'émission à couplage de cristaux photoniques pour la détection de l'iodure femtomolaire et du cortisol zeptomolaire. ACS Appl. Mater. Interfaces 12, 34323–34336 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, JN, Huang, Q., Liu, KK, Singamaneni, S. & Cunningham, BT Hybrides nanoantenne-microcavité avec couplage plasmonique-photonique hautement coopératif. Nano Lett. 17, 7569–7577 (2017).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Joannopoulos, JD Cristaux photoniques : Moulage du flux de lumière 2e édition (Princeton University Press, 2008).

Fan, S., Suh, W. & Joannopoulos, JD Théorie du mode couplé temporel pour la résonance de Fano dans les résonateurs optiques. J. Opt. Soc. Suis. Une Opt. Image Sci. Vis. 20, 569-572 (2003).

Article ADS PubMed Google Scholar

Kolchin, P. et al. Facteur de Purcell élevé dû au couplage d'un seul émetteur à un guide d'ondes à fente diélectrique. Nano Lett. 15, 464–468 (2015).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Ganesh, N. et al. Extraction de fluorescence assistée en mode fuite : application aux biocapteurs d'amélioration de la fluorescence. Opter. Express 16, 21626–21640 (2009).

Article ADS CAS Google Scholar

Pokhriyal, A., Lu, M., Chaudhery, V., George, S. & Cunningham, BT Émission de fluorescence améliorée à l'aide d'un cristal photonique couplé à une cavité optique. Lettres de physique appliquée. 102. 221114 (2013).

Article ADS CAS Google Scholar

Ganesh, N. et al. Émission de fluorescence améliorée à partir de points quantiques sur une surface de cristal photonique. Nat. Nanotechnologie. 2, 515-520 (2007).

Article ADS PubMed Google Scholar

Zhang, L., Wang, J., Tao, S., Geng, C. & Yan, Q. Substrat universel d'amélioration de la fluorescence basé sur un cristal photonique à hétérostructure multiple avec une bande d'arrêt super large et des performances de détection Cr (VI) très sensibles. Adv. Opter. Mater. 6, 1701344 (2018).

Article CAS Google Scholar

Eftekhari, E. et al. Amélioration de la fluorescence anormale à partir de cristaux photoniques colloïdaux 3D à double hétérostructure - une plate-forme de capteurs multifonctionnelle basée sur la fluorescence. Sci. Rep. 5, 14439 (2015).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mitchell, PS et al. MicroARN circulants comme marqueurs sanguins stables pour la détection du cancer. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 105, 10513–10518 (2008).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bettegowda, C. et al. Détection de l'ADN tumoral circulant dans les tumeurs malignes humaines à un stade précoce et avancé. Sci. Trad. Méd. 6, 224ra224 (2014).

Article CAS Google Scholar

Ortholan, C. et al. MicroARN et cancer du poumon : nouveaux oncogènes et suppresseurs de tumeurs, nouveaux facteurs pronostiques et cibles thérapeutiques potentielles. Courant. Méd. Chim. 16, 1047-1061 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rosell, R., Wei, J. et Taron, M. Signatures de microARN circulants d'exosomes dérivés de tumeurs pour le diagnostic précoce du cancer du poumon non à petites cellules. Clin. Cancer du poumon 10, 8–9 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Donaldson, J. & Park, BH ADN tumoral circulant : mesure et utilité clinique. Annu. Rév. Med. 69, 223-234 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Huang, X. et al. Exosomal miR-1290 et miR-375 comme marqueurs pronostiques dans le cancer de la prostate résistant à la castration. EUR. Urol. 67, 33–41 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

El-Khoury, V., Pierson, S., Kaoma, T., Bernardin, F. & Berchem, G. Évaluation de la récupération des miARN cellulaires et circulants : l'impact de la méthode d'isolement de l'ARN et la quantité de matériel d'entrée. Sci. Rep. 6, 19529 (2016).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, G. et al. Conception programmable d'essais de diagnostic d'acide nucléique isothermes grâce à des modèles basés sur l'abstraction. Nat. Commun. 13, 1635 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hunt, EA, Broyles, D., Head, T. & Deo, SK Détection de microARN : technologie actuelle et stratégies de recherche. Annu. Rév. Anal. Chim. (Palo Alto, Californie) 8, 217–237 (2015).

Article CAS Google Scholar

Hunt, EA, Broyles, D., Head, T. & Deo, SK Détection de microARN : technologie actuelle et stratégies de recherche. Annu. Rév. Anal. Chim. (Palo Alto, Californie) 8, 217–237 (2015).

Article CAS Google Scholar

Wu, YF, Tilley, RD & Gooding, JJ Défis et solutions dans le développement de biocapteurs ultrasensibles. Confiture. Chim. Soc. 141, 1162-1170 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Labib, M., Sargent, EH & Kelley, SO Méthodes électrochimiques pour l'analyse de biomolécules cliniquement pertinentes. Chim. Rév. 116, 9001–9090 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tavallaie, R. et al. L'hybridation d'acide nucléique sur un réseau reconfigurable électriquement de nanoparticules magnétiques recouvertes d'or permet la détection de microARN dans le sang. Nat. Nanotechnologie. 13, 1066-1071 (2018).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Johnson-Buck, A. et al. Empreinte cinétique pour identifier et compter les acides nucléiques uniques. Nat. Biotechnol. 33, 730–732 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ronkainen, NJ, Halsall, HB & Heineman, WR Biocapteurs électrochimiques. Chim. Soc. Rev.39, 1747–1763 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vashist, SK, Luppa, PB, Yeo, LY, Ozcan, A. & Luong, JHT Technologies émergentes pour les tests au point de service de nouvelle génération. Tendances Biotechnol. 33, 692–705 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ganesh, N. et al. Extraction de fluorescence assistée en mode fuite : application aux biocapteurs d'amélioration de la fluorescence. Opter. Express 16, 21626–21640 (2008).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Zhen, B. et al. Permettre une émission améliorée et un laser à bas seuil de molécules organiques à l'aide de résonances Fano spéciales de cristaux photoniques macroscopiques. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 110, 13711–13716 (2013).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Purcell, E. Probabilités d'émission spontanée aux fréquences radio. Phys. Rév. 69, 674–674 (1946).

Google Scholar

Joannopoulos, JD, Johnson, SG, Winn, JN & Meade, RD Moulage du flux de lumière. P190-P263 (Princeton Univ. Press, Princeton, NJ 2008).

Xiong, Y. et al. Microscopies activées par les métamatériaux photoniques. Capteurs 22, 1086 (2022).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, Q. et al. Examen critique : détection biomoléculaire à résolution numérique pour le diagnostic et la recherche en sciences de la vie. Puce de laboratoire 20, 2816–2840 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le, P. et al. Compter les facteurs de croissance dans des cellules individuelles avec des points quantiques infrarouges pour mesurer les distributions de stimulation discrètes. Nat. Commun. 10, 909 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lim, SJ et al. Points quantiques égalisés en luminosité. Nat. Commun. 6, 8210 (2015).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Wang, Y., Fruhwirth, G., Cai, E., Ng, T. & Selvin, PR Imagerie super-résolution 3D avec points quantiques clignotants. Nano Lett. 13, 5233–5241 (2013).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Shimizu, KT, Neuhauser, RG, Leatherdale, CA, Empedocles, SA, Woo, WK & Bawendi, MG Statistiques de clignotement dans des points quantiques de nanocristaux à un seul semi-conducteur. Phys. Rev. B 63, 205316 (2001).

Nirmal, M., Dabbousi, BO, Bawendi, MG, Macklin, JJ, Trautman, JK, Harris, TD & Brus, LE Intermittence de fluorescence dans des nanocristaux simples de séléniure de cadmium. Nature 383, 802–804 (1996).

Ma, X., Tan, H., Kipp, T. & Mews, A. Amélioration de la fluorescence, suppression du clignotement et états gris de nanocristaux semi-conducteurs individuels proches des nanoparticules d'or. Nano Lett. 10, 4166–4174 (2010).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Bitton, O., Gupta, SN & Haran, G. Plasmonique des points quantiques : du couplage faible au couplage fort. Nanophotonique 8, 559–575 (2019).

Article CAS Google Scholar

Huang, X. et al. Exosomal miR-1290 et miR-375 comme marqueurs pronostiques dans le cancer de la prostate résistant à la castration. Eur Urol. 67, 33–41 https://doi.org/10.1016/j.eururo.2014.07.035 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kachakova, D. et al. Combinaisons d'antigènes sériques spécifiques de la prostate et de niveaux d'expression plasmatiques de let-7c, miR-30c, miR-141 et miR-375 en tant que meilleurs biomarqueurs diagnostiques potentiels du cancer de la prostate. Cellule ADN Biol. 34, 189-200 (2015).

Nguyen, HC et al. Différences d'expression des microARN circulants dans le cancer de la prostate métastatique résistant à la castration et le cancer de la prostate localisé à faible risque. Prostate 73, 346–354 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wach, S. et al. Les taux sériques combinés de miR-375 et du récepteur de l'activateur du plasminogène de l'urokinase sont suggérés comme biomarqueurs diagnostiques et pronostiques du cancer de la prostate. Int J. Cancer 137, 1406–1416 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Robert, M., Dirks, JSB, Schaeffer, JM, Winfree, E. & Pierce, NA Analyse thermodynamique des brins d'acide nucléique en interaction. SIAM Rév. 49, 65–88 (2007).

Article ADS MathSciNet MATH Google Scholar

Zhang, DY, Chen, SX et Yin, P. Optimisation de la spécificité de l'hybridation des acides nucléiques. Nat. Chim. 4, 208-214 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Podbiel, D., Laermer, F., Zengerle, R. & Hoffmann, J. Fusion de la technologie MEMS avec un laboratoire sur puce : réseaux de microcavités en silicium à l'échelle du nanolitre pour la quantification numérique de l'ADN et les tests multiplex. Microsystème. Nanoeng. 6, 82 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, G. et al. Une puce microfluidique à double pont à auto-numérisation pour la PCR numérique. Micromachines (Bâle) 11, 1025 (2020).

Article Google Scholar

Kreutz, JE et al. Conception théorique et analyse d'essais numériques multivolumes à large plage dynamique validés expérimentalement avec la PCR numérique microfluidique. Anal. Chim. 83, 8158–8168 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Smith, L., Kohli, M. & Smith, AM Élargissement de la plage dynamique des dosages de fluorescence grâce au comptage d'une seule molécule et à l'étalonnage de l'intensité. Confiture. Chim. Soc. 140, 13904–13912 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, X. et al. Caractérisation des microARN dans le sérum : une nouvelle classe de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer et d'autres maladies. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cai, S. et al. Détection multiplexée sans amplification d'une seule molécule de microARN circulants biomarqueurs du cancer à partir du sérum. Nat. Commun. 12, 3515 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradley, D. & Roth, G. Seuil adaptatif utilisant l'image intégrale. J. Graphique. outils 12, 13–21 (2007).

Article Google Scholar

Kim, T. & Paik, J. Amélioration adaptative du contraste à l'aide d'une égalisation d'histogramme écrêté à gain contrôlable. Transactions IEEE sur l'électronique grand public. 54, 1803–1810 (2008).

Kang, W. et al. miR-375 est impliqué dans la voie Hippo en ciblant l'axe YAP1/TEAD4–CTGF dans la cancérogenèse gastrique. Mort cellulaire Dis. 9, 1–16 (2018).

Article CAS Google Scholar

Jaqaman, K. et al. Suivi robuste d'une seule particule dans des séquences accélérées de cellules vivantes. Nat. Méthodes 5, 695–702 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canady, TD et al. Détection à résolution numérique de microARN avec une sélectivité à base unique par microscopie d'absorption à résonateur photonique. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 19362–19367 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Walt, DMRDR Lecture numérique de la concentration de molécules enzymatiques uniques à l'aide de matrices de femtolitres et de statistiques de Poisson. Nano Lett. 6, 520-523 (2006).

Article ADS PubMed CAS Google Scholar

Squires, TM, Messinger, RJ & Manalis, SR Making it stick: convection, reaction and diffusion in surface-based biocapteurs. Nat. Biotechnol. 26, 417-426 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kanik, FE et al. Détection de microARN de sensibilité attomolaire à l'aide de puces numériques en temps réel. Préimpression à ChemRxiv (2022).

Cretich, M., Daaboul, GG, Sola, L., Ünlü, MS & Chiari, M. Détection numérique de biomarqueurs assistée par des nanoparticules : application au diagnostic. Tendances Biotechnol. 33, 343-351 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Ce travail est soutenu par les National Institutes of Health (NIH) R01-GM108584 (BTC), R01-CA227699 (AMS, BTC et MK), R01-CA212097 (MK), National Science Foundation (NSF) CBET-1900277 (BTC ), la bourse postdoctorale de l'Institut Carl Woese de biologie génomique (TC et LZ) et le Cancer Center de l'Illinois pour la bourse de recherche C * STAR (YX) et la bourse TiME (OHA). Les auteurs remercient GA Fried, G. Popescu, JANT Soares, PR Selvin, S. Sarkar, OR Teniola, DE Vaz, LE Kwon, J. Tibbs, S. Shepherd, BK Maity, AJ Cyphersmith, E. Araud, C. -W. Kuo, Y. Zhuo, P. Le, F.-C. Hsiao, LD Akin, S. Nalla, N. Chauhan, A. Igarashi et le reste du groupe Nanosensor pour de précieuses discussions. Les auteurs remercient H. Zhou, JC Spear, KA Walsh, W. Swiech et KM Flatt du laboratoire de recherche sur les matériaux de l'Université de l'Illinois à Urbana-Champaign pour leur formation et leur soutien, et W. Wang pour l'aide au nettoyage des lamelles. Les auteurs reconnaissent également MOXTEK, Inc. et Y. Yan pour avoir fourni les images SEM de la structure du réseau.

Département de génie électrique et informatique, Université de l'Illinois à Urbana−Champaign, Urbana, IL, 61801, États-Unis

Yanyu Xiong, Qinglan Huang, Priyash Barya, Shengyan Liu, Caitlin M. Race et Brian T. Cunningham

Holonyak Micro and Nanotechnology Laboratory, Université de l'Illinois à Urbana−Champaign, Urbana, IL, 61801, États-Unis

Yanyu Xiong, Qinglan Huang, Taylor D. Canady, Priyash Barya, Shengyan Liu, Caitlin M. Race, Congnyu Che, Xiaojing Wang, Lifeng Zhou, Xing Wang, Andrew M. Smith et Brian T. Cunningham

Institut Carl R. Woese de biologie génomique, Université de l'Illinois à Urbana−Champaign, Urbana, IL, 61801, États-Unis

Taylor D. Canady, Xiaojing Wang, Lifeng Zhou, Xing Wang et Brian T. Cunningham

Département de bioingénierie, Université de l'Illinois à Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, États-Unis

Opeyemi H. Arogundade, Congnyu Che, Xing Wang, Andrew M. Smith et Brian T. Cunningham

Département d'oncologie, Huntsman Cancer Institute, Salt Lake City, UT, 84112, États-Unis

Manish Kohli

Carle Illinois College of Medicine, Urbana, Illinois, 61801, États-Unis

Andrew M.Smith

Département de science et génie des matériaux, Université de l'Illinois à Urbana-Champaign, Urbana, IL, 61801, États-Unis

Andrew M.Smith

Cancer Center at Illinois, Urbana, IL, 61801, USA

Andrew M. Smith et Brian T. Cunningham

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

YX et BTC ont conçu et conçu toutes les expériences. YX a effectué toutes les expériences optiques, les expériences d'essais biologiques, a construit la configuration optique PCEF avec l'aide de QH, CMR, Xing W. et LZYX, QH, AMS, LZSL Xiaojing W. et TDC ont interprété les données. CMR a conçu la structure du PC et le logiciel de balayage de ligne. YX et TDC ont conçu le test de pont. YX, PB, SL et QH ont effectué les simulations. SL, YX et PB ont calculé le facteur d'amélioration. L'OHA a réalisé l'électrophorèse sur gel. CC a réalisé la simulation de diffusion. YX a effectué une caractérisation SEM, TEM, AFM et optique. LZ et Xing W. ont fourni des matériaux expérimentaux pour le dosage biologique dans le sérum humain. BTC, AMS, MK et Xing W. ont supervisé l'étude. MK a identifié le biomarqueur cible miARN. YX a écrit le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Brian T. Cunningham.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie le(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Xiong, Y., Huang, Q., Canady, TD et al. Émission de fluorescence améliorée par cristal photonique et suppression du clignotement pour la biodétection à résolution numérique à point quantique unique. Nat Commun 13, 4647 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32387-w

Télécharger la citation

Reçu : 21 juin 2021

Accepté : 29 juillet 2022

Publié: 08 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-32387-w

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

Examen optique (2023)

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.