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Cell Death & Disease volume 14, Article number: 319 (2023) Citer cet article

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Une forte corrélation entre l'expression tumorale NOS2 et COX2 et les mauvais résultats cliniques dans le cancer du sein ER a été établie. Cependant, les mécanismes d'induction tumorale de ces enzymes ne sont pas clairs. L'analyse de The Cancer Genome Atlas (TCGA) a révélé des corrélations entre l'expression de NOS2 et COX2 et les cytokines Th1. Ici, l'analyse RNAseq unicellulaire des cellules TNBC montre une puissante induction de NOS2 et COX2 par l'IFNγ combiné à l'IL1β ou au TNFα. Étant donné que l'IFNγ est sécrété par les lymphocytes cytolytiques, qui améliorent les résultats cliniques, ce rôle de l'IFNγ présente une dichotomie. Pour explorer cette énigme, les cellules T tumorales NOS2, COX2 et CD8 + ont été analysées spatialement dans les tumeurs du sein agressives ER–, TNBC et HER2 +. Une expression élevée et un regroupement des cellules tumorales exprimant NOS2 se sont produits à l'interface tumeur/stroma en présence de lymphocytes T CD8+ restreints au stroma. L'expression élevée et le regroupement des cellules tumorales exprimant COX2 se sont étendus dans les régions désertiques immunitaires du noyau tumoral où la pénétration des lymphocytes T CD8 + était limitée ou absente. De plus, les cellules tumorales exprimant fortement NOS2 étaient proches des zones présentant une satellitose accrue, ce qui suggère des amas cellulaires avec un potentiel métastatique plus élevé. D'autres expériences in vitro ont révélé que l'IFNγ + IL1β/TNFα augmentait l'allongement et la migration des cellules tumorales traitées. Cette analyse spatiale du microenvironnement tumoral fournit des informations importantes sur les quartiers distincts où les cellules T CD8 + restreintes au stroma existent à proximité des niches tumorales exprimant NOS2 qui pourraient avoir un potentiel métastatique accru.

Les cancers du sein alpha-négatifs (ER-) et triple-négatifs (TNBC) des récepteurs aux œstrogènes représentent une proportion plus faible de types de cancer du sein, mais font partie des tumeurs malignes les plus agressives avec des stratégies de traitement limitées par rapport aux tumeurs ER + moins agressives [1]. Au cours de la dernière décennie, une proportion significative de cancers ont démontré une expression élevée de NOS2 [2], où des cancers allant du mélanome au gliome surexpriment NOS2 [3,4,5,6]. Dans le cancer du sein, une augmentation de la NOS2 a été rapportée chez > 70 % des patientes [7]. Fait intéressant, l'expression élevée de la tumeur NOS2 était corrélée à la mutation P53 et était prédictive d'une faible survie chez les patientes ER− (Hazard Ratio = 6) mais pas chez les patientes atteintes d'un cancer du sein ER + [7, 8]. Alors qu'une expression tumorale élevée de COX2 était également prédictive d'un mauvais résultat tel que défini par un HR de 2,45 chez les patients ER- de la même cohorte [9], une coexpression élevée de NOS2/COX2 était fortement prédictive d'un mauvais résultat (HR 21) [10]. Ces résultats suggèrent qu'une coexpression élevée de la tumeur NOS2/COX2 entraîne la progression des phénotypes agressifs du cancer du sein [10, 11] ; cependant, les mécanismes d'induction de NOS2/COX2 dans les tumeurs restent flous.

L'examen de l'Atlas du génome du cancer (TCGA) a révélé des corrélations entre l'expression tumorale de NOS2/COX2 et l'interféron-gamma (IFNγ), l'interleukine-17 (IL17), l'IL1 et le récepteur de type péage-4 (TLR4), qui sont fréquemment associés avec des effets anticancéreux [12]. Fait intéressant, ces associations sont contradictoires car une expression tumorale élevée de NOS2/COX2 prédit de mauvais résultats cliniques [7, 9, 10]. Récemment, une expression élevée de NOS2 et de COX2 a été découverte dans des cellules immunitaires et tumorales distinctes lors d'un traitement avec de l'IFNγ et des cytokines ou des agonistes de TLR4, conformément à la signalisation anticipée de NOS2/COX2, comme indiqué précédemment [10, 13]. Ces résultats suggèrent une relation orthogonale entre l'expression tumorale NOS2/COX2, ce qui pourrait favoriser des microenvironnements tumoraux distincts qui contribuent à de mauvais résultats cliniques [13].

Pour explorer ces possibilités, nous montrons ici que les cytokines Th1 stimulent efficacement l'expression de NOS2 et COX2 dans les cellules tumorales in vitro. L'analyse de l'ARNseq unicellulaire (scRNAseq) a révélé que l'IFNγ combiné à l'interleukine 1β (IL1β) ou au facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα) induisait une expression plus élevée de NOS2 / COX2 que les cytokines en tant qu'agents uniques. De plus, les cytokines qui étaient régulées positivement dans les tumeurs mammaires exprimant fortement NOS2 [7, 10], y compris IL6 et IL8, ont été induites par ces traitements et corrélées à l'expression de NOS2/COX2. De plus, cette étude révèle une synergie unique entre IL1α/β qui améliore l'expression de NOS2 et COX2. L'imagerie spatiale multiplex a révélé des amas de cellules exprimant une NOS2 élevée à proximité des zones de cellules T CD8 + restreintes au stroma qui sont connues pour produire de l'IFNγ et suggèrent une petite niche inflammatoire à l'interface tumeur / stroma dans ces tumeurs. Alors que la COX2 était présente dans ces régions, elle était plus fortement exprimée plus loin dans la tumeur, dans les zones désertiques immunitaires avec une faible pénétration des lymphocytes T CD8+. La comparaison de sites distincts au sein d'une même tumeur, ou de régions géographiques entre tumeurs, suggère une progression spatiale et temporelle des sites inflammatoires dans les zones de cellules lymphoïdes restreintes, qui évolue vers un désert immunitaire dans les zones d'expression élevée de COX2. Ces nouvelles observations fournissent des empreintes digitales spatiales distinctes de phénotypes tumoraux agressifs qui sont en corrélation avec une diminution de la survie au cancer du sein spécifique à la maladie [7, 10].

Nos travaux antérieurs comparant l'expression tumorale élevée et faible de NOS2 et COX2 (également connu sous le nom de PTGS2) ont révélé des associations avec une variété de marqueurs inflammatoires qui sont généralement associés à l'activité antitumorale [10], ce qui nous a incités à explorer les effets régulateurs des cytokines sur l'expression de NOS2/COX2. dans les cellules et tissus tumoraux. Une analyse de corrélation a été réalisée à l'aide du navigateur Xena et de la base de données TCGA pour mieux comprendre les conditions associées aux expressions NOS2 et COX2 dans le cancer du sein ER. L'analyse de corrélation de TCGA-BRCA (cancer du sein) a révélé plusieurs voies inflammatoires associées à une expression tumorale accrue de NOS2/COX2 (Fig. 1A) qui ont influencé les résultats cliniques (Fig. 1B), notamment l'IFNγ, le TNFα, l'IL2, l'IL1 associés aux antitumoraux. , et les voies IL17 (Fig. 1A). De plus, les expressions tumorales NOS2 / COX2 étaient positivement corrélées et les cytokines Th1 présentaient l'association positive la plus forte avec COX2, tandis que IL1β était associée à NOS2 (Fig. 1A). Ces résultats suggèrent une dichotomie au sein du microenvironnement tumoral (TME), où les cytokines qui sont généralement associées à des résultats favorables favorisent également des expressions tumorales élevées de NOS2/COX2 (Fig. 1A), qui sont de puissants prédicteurs d'une faible survie spécifique à la maladie dans les urgences mammaires. patients cancéreux (Fig. 1B) [7, 9, 10]. Pour confirmer les rôles régulateurs de ces cytokines dans l'induction de l'expression de NOS2 et/ou de COX2, des cellules cancéreuses du sein MDA-MB231 (MB231) ont été stimulées avec de l'IFNγ en présence et en l'absence de TNFα, IL1β, IL17 et le TLR4 lipopolysaccharide agoniste (LPS). Les données RNAseq unicellulaires ont révélé qu'une exposition de 48 h à l'IFNγ combiné au TNFα ou à l'IL1β induisait les expressions les plus élevées de NOS2 et COX2 (Fig. 1C). Conformément aux rapports précédents dans les tumeurs murines [12], une expression élevée de NOS2 nécessite IFNγ et TNFα/IL1, qui présentent une différence frappante dans les cytokines produites lors de l'induction de macrophages murins et de cellules tumorales [12]. De plus, le scRNAseq de cellules MB231 stimulées par des cytokines a révélé qu'une stimulation de 48 h avec de l'IFNγ en présence d'IL1β ou de TNFα induisait les expressions les plus élevées de NOS2 et de COX2, regroupées dans les mêmes régions du tracé t-SNE (Fig. 1C, D ). Ces résultats confirment qu'une expression élevée de NOS2 et de COX2 est induite par l'IFNγ combiné à l'IL1β ou au TNFα, comme le montre l'analyse TCGA. Comme prévu, l'analyse scRNAseq de l'IFNγ + IL1β/TNFα a révélé une augmentation des niveaux de transcription de NOS2 et COX2 dans les cellules MB231 traitées. Le nombre de transcrits NOS2 variait de 1 à 3, tandis que les transcrits COX2 avaient une plage significativement plus large (Fig. 1D). Alors que moins de 9% des cellules contenaient des transcrits NOS2, jusqu'à 40% des cellules contenaient des transcrits COX2 (Fig. 1D). L'expression de NOS2 nécessitait l'IFNγ, tandis que l'expression de la COX2 était faiblement induite par l'IL1β ou le TNFα seul (Fig. 1D). Néanmoins, d'une manière similaire à NOS2, l'expression la plus forte de COX2 s'est produite par IFNγ + IL1β/TNFα. En plus de la stimulation des cytokines, la signalisation prédictive de NOS2/COX2 pourrait également favoriser une expression élevée de NOS2/COX2 (Fig. 1A), comme indiqué précédemment [10].

Affichage de la carte thermique AA de l'analyse de corrélation de Pearson de la base de données TCGA-BRCA (n = 1248) via le navigateur UCSC Xena analysant Th1, Th2, Th17 et deux gènes GOI (gène d'intérêt). La heatmap a été générée dans corrplot (0.92) dans R (4.2.1). B Analyse de survie associée aux expressions des protéines tumorales NOS2lo/COX2hi (flèche bleue), NOS2lo/COX2lo (flèche verte), NOS2hi/COX2lo (flèche jaune) et NOS2hi/COX2hi (flèche rouge). Graphique C t-SNE (Loupe Browser 6.3.0) d'une analyse unicellulaire de cellules MB231 traitées avec une seule ou une combinaison de cytokines IFNγ (100 U/ml), IL1β (10 ng/ml), TNFα (10 ng/ml) , IL17 (100 ng/ml) et LPS (10 ng/ml) pendant 24 et 48 h. Les amas de couleur vert clair et vert foncé représentent des points temporels de 24 et 48 h associés au traitement IFNγ + IL1β / TNFα, respectivement. Le cercle orange indique le regroupement de cellules superposées le plus élevé pour l'IFNγ + IL1β ou TNFα après 48 h de traitement. Parcelles D t-SNE des cellules de regroupement NOS2 et COX2. Les graphiques à barres empilées montrent le nombre de transcrits NOS2 et COX2 par cellule dans les groupes de traitement de 48 h. Les données de transcription par cellule (code couleur : bleu, 1 ; orange, 2 ; gris, 3 ; jaune, 4 ; cyan, 5 ; vert, 6) ont été extraites à l'aide des packages R (data.table 1.14.2, dplyr 1.0.10 , et ggplot2 3.3.6).

Des marqueurs de la souche cancéreuse ont été rapportés dans des populations cellulaires avec des niveaux d'expression élevés de CD44 et de CD24 réduits qui présentaient les mêmes caractéristiques histopathologiques résistantes aux médicaments que la tumeur dérivée lorsqu'elles étaient injectées à des souris à de très faibles concentrations [14]. Ici, l'analyse du tracé t-SNE de l'expression de CD44 / CD24 a révélé des modèles de regroupement distincts (Fig. 2A) définis par une augmentation des niveaux de CD44 et de CD24 dans des grappes exprimant NOS2 / COX2 après un traitement de 48 h avec IFNγ + IL1β ou TNFα. Ce schéma suggère une augmentation de la souche du cancer [14] et est cohérent avec les rapports antérieurs sur les taux élevés de CD44 dans les tumeurs du sein ER-exprimant NOS2 [7, 15]. L'expression de l'inhibiteur tissulaire métalloprotéinase-1 (TIMP1), un marqueur de fibrose [16], était similaire à CD44, indiquant que leurs expressions étaient probablement contrôlées par le même régulateur en amont (Fig. 2A). Pour explorer les relations d'expression entre les cytokines Th1, nous avons analysé les modèles de regroupement d'IL6, IL8, IL1α et IL1β (Fig. 2B). Les modèles de regroupement de ces cytokines sont très similaires et se chevauchent fortement après 48 h de stimulation avec IFNγ + IL1β / TNFα (Fig. 2B). De plus, l'examen d'autres gènes induits par les cytokines a révélé une forte association avec l'IL1α/β (Fig. 2C) et est cohérent avec les observations démontrant que l'IL1β circulant prédit une faible survie [17]. Ensemble, ces résultats appuient l'analyse de corrélation TCGA-BRCA illustrée à la Fig. 1A.

A t-SNE parcelles de marqueurs de cellules souches cancéreuses (CD24/CD44) et de fibrose (TIMP1) et de marqueurs de cytokine B Th1 (IL6, IL8, IL1β, IL1α), qui se sont regroupés dans les mêmes régions que NOS2/COX2 montrées dans le panneau A. C Analyse de corrélation de cytokines sélectionnées, de marqueurs de cellules souches cancéreuses et de gènes associés aux métastases. Les données ont été extraites des groupes de contrôle de 48 h, IFNγ, IL1β et IFNγ + IL1β dans corrplot (0, 92) dans R (4.2.1). NOS2 n'a pas été exprimé dans les cellules témoins et traitées à l'IL1β et n'est donc pas représenté dans l'analyse de corrélation.

Les résultats in vitro ci-dessus démontrent que l'IFNγ est un régulateur clé dans l'induction de l'expression de NOS2/COX2 dans les cellules tumorales du sein ER-, ce qui soulève la question de l'origine de la sécrétion d'IFNγ dans les tissus tumoraux. Les lymphocytes cytotoxiques libèrent de l'IFNγ et sont associés à une amélioration de la survie dans le TNBC et d'autres types de cancer [18,19,20]. En revanche, une expression tumorale élevée de NOS2/COX2 favorise la progression de la maladie et est fortement prédictive d'une faible survie au cancer du sein spécifique à la maladie [7, 9, 10]. Ces résultats impliquent une dichotomie dans laquelle les cellules IFNγ productrices de lymphoïdes antitumoraux pourraient induire des niches cellulaires pro-tumorales exprimant NOS2 / COX2, ce qui peut être dû à l'hétérogénéité au sein du TME. Pour explorer cette hypothèse, la proximité spatiale et la relation entre les lymphocytes T CD8+ qui produisent l'IFNγ et les cellules tumorales exprimant NOS2/COX2 ont été examinées dans 21 tumeurs du sein ER- (dont TNBC (n = 14) et HER2/neu+ (n = 7 ) phénotypes) en utilisant l'imagerie spatiale multiplex. L'imagerie par fluorescence permet la visualisation et la quantification des voisinages cellulaires au niveau de la cellule unique. Des cellules exprimant fortement NOS2 et COX2 ont été observées dans des régions distinctes du TME, comme illustré sur la figure 3A. Les analyses de distribution spatiale et de carte thermique de densité de l'ensemble de la tumeur révèlent des régions distinctes de cellules T NOS2, COX2 et CD8 + où des cellules exprimant NOS2 et COX2 (Fig. 3B, C) ont été observées dans des quartiers séparés. De plus, des densités de lymphocytes T CD8 + plus élevées ont été observées près des cellules exprimant NOS2, tandis que des densités plus faibles ont été identifiées près des amas exprimant COX2 (Fig. 3B, C). Ainsi, des cellules exprimant NOS2 et COX2 spatialement distinctes par rapport aux cellules T CD8 + dans les tumeurs mammaires agressives suggèrent une association entre les cellules T CD8 + et les niches NOS2 / COX2 induites par les cytokines qui influencent les résultats cliniques.

Une fluorescence multiplex d'une tumeur du sein ER-/HER2 + montrant NOS2 (rouge), COX2 (vert), CKSOX10 (bleu), CD8 + cellules T (magenta) et DAPI (blanc). B Distribution spatiale (à gauche) et cartes thermiques de densité (à droite) des lymphocytes T NOS2, COX2 ou CD8+. Les distributions spatiales reflètent une détection positive des marqueurs dans des zones de 25 µm de diamètre indépendamment de la quantité. Les cartes thermiques de densité fournissent une quantification visuelle reflétée par la gradation de couleur (faible-élevée) bleu, vert, jaune, orange et rouge des expressions de la protéine biomarqueur. C comparaison des combinaisons de distribution spatiale NOS2/CD8, COX2/CD8 et NOS2/COX2.

Les expressions NOS2/COX2 dans les tumeurs ER- précédemment notées comme NOS2/COX2 haut (hi) ou bas (lo) par des grades d'immunohistochimie (IHC) de routine de 1 à 4 [7, 9] ont été analysées pour l'intensité de fluorescence NOS2/COX2 au au niveau de la cellule unique à l'aide de l'imagerie par fluorescence multiplexée, qui fournit des informations spatiales au niveau de la cellule unique dans des régions telles que la nécrose, le stroma et la tumeur viable. Les régions viables de la tumeur et du stroma ont été annotées par un pathologiste vétérinaire sur des images H&E (QuPath) [21] et fusionnées avec l'expression fluorescente NOS2/COX2 à l'aide du logiciel HALO (Fig. 4A). Les intensités de fluorescence NOS2 et COX2 ont été déterminées pour chaque tumeur à l'aide d'un réglage en temps réel dans le logiciel HALO, puis les intensités moyennes et les écarts-types (SD) ont été déterminés. Les intensités de seuil pour les niveaux d'expression faibles, modérés et forts ont été déterminées en ajoutant 2, 4 ou 6 SD, respectivement, au réglage de seuil d'intensité moyenne. Les intensités de fluorescence NOS2 / COX2 de la tumeur entière quantifiées à partir de ces seuils (Fig. 1A supplémentaire) étaient cohérentes avec les niveaux d'expression NOS2 / COX2 notés par le pathologiste IHC original précédemment rapportés [7, 9]. Lors de la stratification de la tumeur par rapport au stroma, l'expression tumorale NOS2 / COX2 avec une intensité de signal forte / modérée était significativement élevée dans les tumeurs exprimant fortement NOS2 / COX2 (Fig. 1B supplémentaire). En revanche, les intensités de signal faible de NOS2 étaient significativement élevées dans le stroma mais pas dans la tumeur, tandis que l'intensité de signal faible de COX2 était plus élevée dans la tumeur mais pas dans le stroma (Fig. 1B supplémentaire). Il a été démontré que la signalisation prédictive NOS2 et COX2 [10] conservent leurs expressions. Une relation linéaire potentielle entre la tumeur NOS2 et COX2 dans ces tumeurs a été examinée à l'aide du coefficient de corrélation de Pearson, qui a révélé des corrélations linéaires entre l'expression de NOS2 et de COX2 à des intensités fortes, modérées et faibles (Fig. 1C supplémentaire). Ensemble, ces résultats prennent en charge la signalisation prédictive NOS2/COX2, comme le montre la figure 1A et comme indiqué précédemment [10].

Une section colorée au H&E (à gauche) fusionnée avec une image fluorescente en série (à droite). Les coupes H&E ont été évaluées par un pathologiste qui a défini les zones de nécrose (violet), de tumeur viable (vert) et de stroma (orange). Les cellules exprimant %NOS2/COX2 dans la tumeur entière ainsi que la tumeur et le stroma sont présentées. B Les zones de la distribution spatiale mises en évidence par les cases bleues étiquetées 1 (en haut), 2 (au milieu) et 3 (en bas) reflètent une progression de (1) régions enflammées de cellules T CD8+ restreintes au stroma vers (2) régions froides avec une réduction cellules T CD8 + restreintes au stroma et (3) régions centrales de la tumeur du désert immunitaire froid dépourvues de cellules T CD8 +. Les analyses spatiales de l'expression de NOS2/COX2 dans ces zones encadrées ainsi que des lymphocytes T CD8+ ou IFNγ sont présentées à un grossissement de 50 μm. Les images enregistrées dans la région enflammée désignée dans l'encadré 1 montrent les cellules T CD8 + restreintes au stroma C (cyan) ou l'expression D IFNγ (cyan) près des cellules exprimant NOS2 (rouge). Les analyses des régions froides désignées dans l'encadré 2 montrent une expression élevée de COX2 et une faible expression de NOS2 avec des lymphocytes T CD8 + limités par E et un IFNγ limité par F. Les analyses des régions du noyau de la tumeur du désert immun associées à l'encadré 3 montrent une expression tumorale élevée de COX2 avec des niveaux réduits de lymphocytes T G CD8 + et une expression réduite de l'IFNγ H.

La figure 4A montre des augmentations significatives du pourcentage de cellules avec une expression tumorale élevée de NOS2/COX2 dans l'ensemble de la tumeur ainsi que dans les régions de la tumeur et du stroma. Un examen plus approfondi des distributions spatiales de NOS2 et COX2 a révélé que les cellules NOS2 + sont regroupées aux marges tumorales ou dans le stroma (Fig. 4B – D). Alors que l'expression de COX2 a été observée près des cellules exprimant NOS2 dans certaines régions, les cellules COX2 + étaient densément regroupées dans des zones distinctes plus profondément dans le noyau de la tumeur ainsi que dans les régions désertiques immunitaires de la tumeur (Fig. 4E – H). Les tumeurs notées NOS2lo/COX2lo présentaient des foyers sporadiques de NOS2 et COX2 de faible densité, où peu ou pas de foyers d'intensité plus élevée ont été observés. En revanche, les tumeurs NOS2hi / COX2hi présentaient de nombreux foyers NOS2 et COX2 à expression élevée, spatialement distincts, avec des clusters NOS2 à l'interface tumeur-stroma (Fig. 4C, D). En revanche, les boîtes 2 à 3 montrent des grappes de COX2 s'étendant plus profondément dans le noyau de la tumeur (Fig. 4E – H). Ainsi, les cellules exprimant NOS2 et COX2 sont spatialement localisées dans des régions inflammatoires distinctes de la tumeur.

Comme représenté sur les Fig. 1D et 2C, l'IFNγ est nécessaire pour une expression optimale de NOS2/COX2 dans les cellules traitées avec la cytokine MB231. Les cellules lymphoïdes, dont les lymphocytes T CD8+, sont une source de sécrétion d'IFNγ [20]. Des études récentes ont démontré un rôle clé dans l'orientation spatiale des lymphocytes T CD8+ pour une meilleure survie dans le TNBC [22]. La pénétration des lymphocytes T CD8+ dans le noyau de la tumeur a défini une tumeur entièrement enflammée qui était prédictive de l'amélioration de la survie des patients TNBC [22]. En revanche, une pénétration limitée des lymphocytes T CD8+ dans le noyau de la tumeur (≤100 lymphocytes T CD8+/mm2) ou des lymphocytes T CD8+ restreints au stroma étaient associés à des microenvironnements immunitaires tumoraux fibrotiques ou immunosuppresseurs, ce qui prédisait une faible survie [22]. Ainsi, la localisation spatiale des lymphocytes T CD8+ est un prédicteur des résultats cliniques [22]. La figure 2 supplémentaire décrit la classification de la forte intensité unicellulaire de NOS2/COX2 par rapport à la présence de lymphocytes T CD8+ dans toutes les tumeurs. Compte tenu du pouvoir prédictif de la localisation spatiale des lymphocytes T CD8 + [22], nous avons observé une abondance de lymphocytes T CD8 + restreints au stroma (Fig. 4C) avec une expression accrue d'IFNγ (Fig. 4D) dans les régions proximales à l'expression élevée de NOS2 tumorale, indiquant une association potentielle entre les lymphocytes T CD8 +, l'IFNγ et la régulation de NOS2 (Fig. 4C, D). En revanche, les figures 4E – H montrent des zones avec des lymphocytes T CD8 + limités, ainsi qu'une expression limitée d'IFNγ et de NOS2. Il est important de noter que COX2 est fortement exprimé dans ces régions (Fig. 4E – H). Les coefficients de corrélation de Pearson ont également été déterminés et ont montré une corrélation significative entre les cellules exprimant la tumeur NOS2hi et les cellules T CD8 + / INFγ (Fig. 3A supplémentaire). Fait intéressant, aucune linéarité significative n'a été observée entre les lymphocytes T CD8 + / IFNγ et l'expression tumorale de COX2 (Fig. 3B supplémentaire). Ces résultats suggèrent que les lymphocytes T CD8+ pourraient fournir une source d'IFNγ conduisant à une expression accrue de NOS2 dans la tumeur.

La stimulation des voies oncogènes par le NO est caractérisée par une augmentation de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), de la migration et de la motilité des cellules cancéreuses aboutissant à la progression de la maladie cancéreuse et à la métastase [23, 24]. Les patients de cette cohorte ont succombé à une maladie métastatique même si le statut de ganglions lymphatiques positifs n'a pas été observé au moment du diagnostic. Les régions NOS2hi étaient proches des cellules T CD8 + restreintes au stroma. Les zones NOS2hi présentaient de petits amas tumoraux qui semblaient se détacher de la lésion primaire (satellitose), indiquant des niches métastatiques (Fig. 5A encadré 1, 5B et 5C). En revanche, la satellitose était absente dans les régions où l'expression tumorale de NOS2 était plus faible ainsi que moins de lymphocytes T CD8 + et d'IFNγ (Fig. 5D, E). Ces résultats indiquent que les foyers de regroupement NOS2hi pourraient favoriser un potentiel métastatique accru, ce qui est cohérent avec les rapports antérieurs [15, 25].

A Distribution spatiale de la tumeur entière avec des cases bleues étiquetées 1 (en haut), 2 (au milieu) et 3 (en bas) montrant le grossissement B, C de la localisation spatiale de NOS2 (rouge) et du marqueur tumoral CKSOX10 (bleu) exprimant des cellules dans une région NOS2hi (50 μm) mise en évidence dans l'encadré 1. Des cellules exprimant NOS2 allongées et groupées qui se sont détachées de la plus grande lésion sont affichées, ce qui indique une satellitose et un potentiel métastatique accru. Ces phénotypes ne sont pas observés dans les régions immunitaires froides (D) ou les régions désertiques immunitaires (E).

La morphologie cellulaire est un aspect clé de la métastase, où les cellules acquièrent un phénotype allongé au cours des processus de migration et d'invasion. Les modèles de migration in vitro ont montré des rôles de NO au cours des processus métastatiques, où l'exposition à un flux de NO plus élevé (100 à 300 nM) pendant 24 à 48 h a augmenté la migration in vitro et l'invasion des cellules cancéreuses du sein MB231 et MB468 [7, 15]. Ces observations antérieures suggèrent qu'une expression et un regroupement accrus de NOS2 dans la tumeur généreraient un flux de NO qui améliore le potentiel métastatique des cellules exposées dans cette niche [15]. Ici, nous avons exploré plus avant l'influence de l'expression de la cellule tumorale NOS2/COX2 sur la morphologie cellulaire altérée. Comme le montrent les figures 6A, B, les cellules MB231 exposées à un traitement individuel ou combiné de cytokines ont démontré des changements morphologiques et un allongement cellulaire caractéristique de l'EMT dans les cellules migrantes et envahissantes. De plus, le test de grattage a montré une fermeture accrue de la plaie après 12 h de traitement combiné IFNγ + TNFα par rapport aux cellules témoins non traitées (Fig. 6C). De même, les essais en chambre de Boyden ont montré une augmentation de l'invasion cellulaire en réponse à un traitement combiné IFNγ + TNFα de 48 h, qui a été réduite par les inhibiteurs pan-NOS / COX (LNAME / Indométhacine) à la fois en tant qu'agents de traitement uniques et en combinaison (Fig. 6D). Ces résultats suggèrent que la régulation à la hausse de l'expression tumorale de NOS2/COX2 dans une niche inflammatoire pourrait générer des phénotypes avec un potentiel métastatique accru (Fig. 6).

A Images au microscope (10X) de cellules MB231 témoins et traitées à la cytokine pendant 48 h. Analyse de l'élongation des cellules B après 48 h de traitement par les cytokines. Test de grattage CA des cellules MB231 après 12 h de traitement aux cytokines. D Test d'invasion cellulaire ; Les cellules MB231 ont été ensemencées dans le puits supérieur d'une chambre de Boyden avec un milieu sans sérum ± cytokines et les inhibiteurs pan-NOS / COX LNAME et indométhacine pendant 48 h. La chambre inférieure était remplie de milieux complets. Les cellules ont été comptées par rapport à la courbe standard. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± ET. *p < 0,05, **p < 0,001, ***p < 0,0001.

L'un des indicateurs pronostiques les plus efficaces pour le cancer du sein ER- est l'association entre NOS2 et COX2 [10, 26]. Les données ci-dessus démontrent un lien inhabituel entre l'IFNγ et les cellules lymphoïdes en termes de résultats cliniques, comme résumé à la Fig. 7. L'IFNγ et les lymphocytes T CD8 + sont liés et nécessaires à la production de niveaux élevés de NOS2 et de COX2, malgré le fait qu'ils sont prédictifs de résultats cliniques positifs et la marque d'un bon pronostic dans de nombreuses tumeurs malignes [22, 27]. Selon les résultats du scRNAseq, l'IFNγ et l'IL1β/TNFα sont nécessaires pour induire les niveaux les plus élevés d'expression de NOS2 et COX2, ce qui suggère que les cellules lymphoïdes pourraient être un facteur contributif à la tumeur. Selon des recherches antérieures, l'IFNγ est essentiel à la stimulation de NOS2 dans les cellules DLD1 (cancer du côlon humain) [28]. De plus, le scRNAseq de MB231 avec IFNγ + IL1β révèle une forte connexion entre NOS2 / COX2 et IL1β, TNFα, IL6 et IL8, renforçant la notion d'un microenvironnement Th1 renforcé acquis auprès du TCGA (Fig. 1). Cela implique des mécanismes immunitaires multifactoriels conduisant à une boucle d'action directe qui favorise l'induction de niches cellulaires exprimant fortement NOS2/COX2 et la progression de la maladie. Des études antérieures ont démontré que l'IFNγ, l'IL6, la PGE2 et l'IL1 ont tous stimulé l'expression de NOS2, suggérant que plusieurs processus de renforcement étaient impliqués dans la régulation à la hausse de NOS2 [15]. De plus, IL1α est un médiateur du stress du RE qui est fréquemment observé dans le TME après chimiothérapie. L'IL1α et l'ILβ ont augmenté en réponse à l'IFNγ et l'IL1β améliore significativement ces voies complémentaires pour l'élévation soutenue des mécanismes NOS2/COX2. Ces facteurs pourraient concourir à créer une niche inflammatoire NOS2/COX2 qui favorise la progression de la maladie.

La sécrétion d'IFNγ par les cellules T CD8 + restreintes au stroma et d'IL1β / TNFα sécrétée par les cellules myéloïdes dans le microenvironnement tumoral conduit à l'expression tumorale de NOS2 / COX2 et au développement de niches cellulaires agressives avec un potentiel métastatique accru et favorise l'immunosuppression. Les quartiers cellulaires exprimant une NOS2/COX2 tumorale élevée augmentent alors IL1α/β, créant une boucle d'anticipation qui maintient l'expression tumorale de NOS2/COX2 et des cytokines élevées, notamment IL8 et IL-6, ainsi que l'activation du TGFβ latent par NO. Ces facteurs conspirent pour favoriser l'immunosuppression, les métastases et la souche du cancer par le NO dérivé de NOS2 et la PGE2 dérivée de COX2.

Bien que la séquence et la biochimie de la protéine soient comparables chez la souris et chez l'homme, le promoteur NOS2 est compliqué et diffère significativement entre les deux espèces [28,29,30]. L'expression de NOS2 dans les macrophages murins induite au maximum in vitro par l'IFNγ ou le LPS a été l'étalon-or dans le domaine du NO, où le flux de NO estimé pouvait atteindre 1 à 5 µM au niveau cellulaire [13]. Les cellules tumorales murines ont montré une activité NOS2 significativement plus élevée en réponse à l'IFNγ ou au LPS, suggérant une distinction clé entre les cellules tumorales et les macrophages [13]. Alors que les données ici démontrent clairement que l'expression maximale de NOS2 humaine est induite par IFNγ, IL1β et TNFα, identique à celle des cellules tumorales murines, les macrophages humains n'activent pas NOS2 avec IFNγ ou LPS. Cependant, les niveaux de NO produits par les cellules tumorales de souris et humaines diffèrent encore de manière significative à un niveau fondamental. Récemment, il a été démontré que le nombre de cellules NOS2+, plutôt que l'expression de NOS2, était corrélé à la quantité de NO et de nitrite produits in vitro [11]. En conséquence, les amas de cellules exprimant NOS2 affecteront les niveaux de NO, et le regroupement des cellules NOS2 peut produire des zones de flux de NO plus important [13, 31]. Des expériences in vitro révèlent que des niveaux élevés de nitrite et de NO sont présents lorsque 50 à 80 % des cellules expriment NOS2 et que les flux sont supérieurs à 100 nM. Cependant, la production de NO est inférieure d'un ordre de grandeur dans 5 % des cancers humains. Nos recherches antérieures démontrent que les voies cancérogènes induites par le NO ont lieu à une concentration idéale de 200 à 400 nM, ce qui augmente l'expression de l'IL6 et de l'IL8 [12]. Néanmoins, les niveaux de NO sont plus élevés lorsque les cellules exprimant NOS2 sont concentrées à une densité beaucoup plus élevée, comme dans des foyers localisés à l'intérieur de la tumeur. Considérés collectivement, ces résultats suggèrent que ces régions de cellules exprimant NOS2 à haute densité ont un flux de NO plus important, ce qui peut déclencher des mécanismes oncogènes qui se produisent dans la plage de 100 à 300 nM de NO dans la boîte de Pétri [32,33,34 ].

Les zones enrichies en cellules T CD8 + et en IFNγ sont liées à la juxtaposition de cellules lymphoïdes et tumorales au sein du TME, ce qui entraîne un regroupement élevé de cellules exprimant NOS2 améliorées. Une étude antérieure portant sur le placement des lymphocytes T CD8 + a démontré que l'orientation spatiale est un facteur crucial dans la détermination des résultats cliniques du TNBC [22]. Des résultats positifs sont décrits par une tumeur pénétrant profondément dans les cellules T CD8 + dans le noyau de la tumeur dans une tumeur complètement enflammée. D'autre part, les lymphocytes T CD8+ restreints au stroma et les régions désertiques immunitaires dépourvues de lymphocytes T CD8+ prédisent de mauvais résultats cliniques [22]. Ici, nous démontrons que des niches cellulaires NOS2 élevées peuvent être formées à la marge de la tumeur et à proximité des cellules T CD8 + restreintes au stroma. Ces niches peuvent désormais rencontrer l'IFNγ et d'autres cytokines qui induisent l'expression tumorale de NOS2/COX2. Au contraire, les cellules NOS2 + et COX2 + sont dispersées et observées à des niveaux inférieurs dans les zones avec une pénétration accrue des cellules T CD8 + dans la tumeur. Les informations susmentionnées démontrent sans équivoque que les cellules T CD8 + et l'IFNγ sont proches de NOS2 et suggèrent qu'une niche inflammatoire avec des cellules T CD8 + restreintes au stroma est nécessaire pour l'induction de NOS2.

Un désert immunitaire dépourvu de lymphocytes T CD8+ est un autre aspect significatif du TME qui a déjà été identifié [22]. Un mauvais résultat clinique est suggéré par un faible nombre de lymphocytes T CD8+ et des lymphocytes T CD8+ épuisés dans le compartiment tumoral [35]. L'un des facteurs critiques de l'absence de lymphocytes T CD8+ associés à un faible IFNγ dans les régions désertiques immunologiques a également été révélé dans les régions déficientes en NOS2 avec une expression accrue de COX2. Cela implique que le désert immunologique est associé à des régions COX2-positives et NOS2-négatives. Des cellules T CD8+ élevées et d'autres cellules lymphoïdes qui sont limitées au stroma ou aux marges tumorales peuvent entraîner des situations qui favorisent une NOS2 et une COX2 plus élevées.

Nos recherches antérieures ont démontré que le NO est essentiel pour favoriser l'EMT et les métastases [15]. Une inflammation accrue au niveau de ces foyers NOS2 augmente la probabilité de métastases, et la découverte de la niche positive NOS2 à l'interface tumeur-stroma suggère que cela pourrait être le site de métastases. L'allongement et l'EMT induits par le NO sont connus pour médier ces effets [15]. En outre, IL1 et PGE2 améliorent l'EMT et la motilité cellulaire dans le cancer du sein [36, 37]. Ici, IFNγ et ILβ1/TNFα favorisent la motilité et l'élongation [7]. En conséquence, les niches inflammatoires NOS2/COX2 augmentent le potentiel de motilité des cellules cancéreuses et de propagation métastatique. Par conséquent, un potentiel métastatique limité peut être atteint par l'inhibition des boucles de réaction NOS2/COX2 [38]. Étant donné que les métastases sont la principale cause de décès par cancer, la localisation spatiale de NOS2/COX2 sur ces sites d'inflammation pourrait fournir un indicateur pronostique précoce de mauvais pronostic, même en l'absence de statut ganglionnaire positif [7].

L'IFNγ joue un rôle clé dans l'induction de réponses immunitaires antitumorales pro-inflammatoires [39]. Cependant, des études récentes ont montré que la réponse IFNγ dépend de la concentration lorsque de faibles niveaux dans le TME favorisent la progression de la maladie protumorigène médiée en partie par la régulation à la baisse des complexes majeurs d'histocompatibilité et la régulation à la hausse de l'indoleamine 2,3-dioxygénase et du ligand de mort cellulaire programmée 1 [39] . De plus, l'IFNγ est nécessaire pour stimuler l'expression spécifique de la tumeur NOS2/COX2, qui, par un processus à multiples facettes, pilote également les voies oncogènes et façonne les profils immunologiques associés à un mauvais pronostic [10, 11]. Étant donné que l'IFNγ est sécrété par les cellules T CD8 + cytolytiques, l'analyse spatiale suggère que la quantité et la localisation des cellules T CD8 + [22] présentent une opportunité pour la formation de processus de régulation de l'IFNγ au sein du TME, y compris la régulation à la hausse de l'expression tumorale NOS2 / COX2 et le développement de niches qui favorisent la progression de la maladie, les métastases et les mauvais résultats cliniques [7, 10, 11, 22].

La lignée cellulaire de cancer du sein humain MDA-MB231 (MB231) a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) et cultivée dans du RPM1-1640 (Invitrogen) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS ; Invitrogen, Waltham, MA) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 dans l'air. Les cellules ont été privées de sérum pendant une nuit avant l'expérimentation. Selon les tests en aval, les cellules ont été incubées pendant 12, 24 ou 48 h avec l'ajout de ddH2O (témoin), IFNγ 100 U/mL (285-IF/CF, R&D Systems, Minneapolis, MN), IL1β 10 ng /mL (201-LB/CF, R&D Systems), TNFα 10 ng/mL (210-TA/CF, R&D Systems), IL17A 10 ng/mL (7955-IL-CF, R&D Systems), lipopolysaccharide (LPS, Sigma , St. Louis, MO) 10 mg/mL (L2630, Sigma), LNAME 500 mM (N5751, Sigma, St. Louis, MO) et/ou Indométhacine 100 μM (I7378, Sigma, St. Louis, MO).

Un million de cellules ont été étalées dans une boîte de 60 mm et autorisées à atteindre 100 % de confluence. Une pointe de pipette de 200 ul a été utilisée pour graver une ligne droite à gratter à travers la monocouche confluente. Les cellules flottantes et mortes ont été éliminées en lavant les boîtes dans du PBS 1X, puis un milieu complet a été ajouté. Un microscope inversé objectif 10x (EVOS, Life Technologies, Carlsbad, CA) a été utilisé pour prendre des images à 0, 4, 8 et 12 h. Le logiciel open-source ImageJ a mesuré le rythme auquel les trous de rayure sont remplis (version 1.53 u) [40].

Un test d'invasion cellulaire (cat # ab235697) dans un format de plaque à 96 puits d'Abcam (Waltham, MA) a été utilisé. Après synchronisation cellulaire, un milieu complet a été donné à la chambre inférieure comme attractif, et 50 000 cellules ont été ensemencées dans la chambre supérieure avec des cytokines ± inhibiteurs pendant 48 h. Les cellules fluorescentes migrées ont été comptées à Ex/EM = 530/590 nm sur un lecteur de plaques SpectraMax i3x (Molecular Devices, San Jose, CA) et comparées à une courbe standard réalisée à partir de la même lignée cellulaire.

La bibliothèque unicellulaire a été générée à l'aide du kit de réactifs 10x Genomics (San Francisco, CA) Single Cell 3' Reagent Kit v3, puis séquencée dans notre installation de séquençage (NCI à Frederick, MD) à l'aide d'un Illumina NovaSeq 6000. Cellules d'échantillon dans un milieu de suspension ont été examinés pour la viabilité avant la préparation de la bibliothèque. Les ADNc ont été séquencés après avoir été codés à barres, regroupés et amplifiés lors de la préparation de la bibliothèque. En moyenne, 10 000 cellules par échantillon ont été séquencées. Le logiciel Cell Ranger a fourni des lectures brutes en entrée (10x Genomics, version 6.1.2). Ils ont été démultiplexés et convertis en fichiers BCL à l'aide du Cell Ranger. Toutes les lectures ont été cartographiées sur le génome de référence humain à l'aide du pipeline de génomique 10x par défaut (version 3.1.0) après avoir passé les contrôles de qualité (GRCH38-30.0). Les comptes de transcription annotés dans chaque cellule ont été utilisés pour construire des matrices de comptage UMI (Unique Molecular Identifier).

Les fichiers matriciels h5 pour chaque échantillon ont été téléchargés sur le serveur Flow interne de Partek (St. Louis, MO) pour le traitement et l'exploration de données. Tous les comptes ont été normalisés à l'aide de la méthode par défaut "comptes par million, ajouter 1 et log2 transformés". L'outil GSA (analyse spécifique des gènes) a ensuite été appliqué pour découvrir les gènes exprimés de manière différentielle entre les différents échantillons expérimentaux. Des changements de pli absolus ≥ 2 et une valeur ap <0, 05 ont été utilisés pour sélectionner les gènes. Nous avons utilisé le navigateur Loupe (version 6.3.0, 10 × Genomics) pour inspecter visuellement les ensembles de données agrégés et autonomes afin d'analyser les modèles de regroupement des données scRNAseq. Pour créer des cartes thermiques de corrélation, les ensembles de données scRNAseq qui avaient été directement traités dans Seurat (version 4.0, laboratoire Satija, https://satijalab.org/seurat/) à partir de la sortie Cell Ranger ont été exportés vers RStudio (2022.07.2 Build 576, https ://posit.co/) en parallèle. Les données unicellulaires sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

Le sous-ensemble du cancer du sein (BRCA) du TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga) a été consulté via l'UCSC (Université de Californie, Santa Cruz) Xena Navigateur (Date d'accès : 11/2/2022, https://xena.ucsc.edu/). En bref, toutes les cytokines Th1, Th2, Th17 ciblées, les gènes NOS2 et COX2 ont été étudiés dans le navigateur Xena, puis exportés vers RStudio (2022.07.2 Build 576) pour une analyse de corrélation ultérieure.

Des échantillons de tumeurs (n = 21) ont été obtenus auprès de patientes atteintes d'un cancer du sein recrutées au centre médical de l'Université du Maryland (UMD), au centre médical des anciens combattants de Baltimore, à l'hôpital Union Memorial, au centre médical Mercy et au Sinai Hospital de Baltimore entre 1993 et 2003. . Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients. La collecte d'échantillons de tumeurs, de données d'enquête et d'informations cliniques et pathologiques (protocole UMD n° 0298229) a été examinée et approuvée par l'UMD Institutional Review Board (IRB) pour les institutions participantes. La recherche a également été examinée et approuvée par le NIH Office of Human Subjects Research (OHSR n° 2248). L'expression de la tumeur mammaire NOS2 et COX2 a été analysée précédemment par IHC en utilisant un anticorps NOS2 dilué au 1:250 et un anticorps COX2 dilué au 1:50 (n° 610328 et 610204, respectivement, BD Biosciences, San Diego, CA) et noté par un pathologiste [7, 9]. Pour la coloration NOS2, un score combiné d'intensité et de distribution a été utilisé pour classer les colorations immunohistochimiques NOS2 où l'intensité a reçu un score de 0 à 3 si la coloration était négative, faible, modérée ou forte. La distribution NOS2 a reçu des scores de 0 à 4 pour les distributions <10%, 10–30%, >30–50%, >50–80% et >80% de cellules positives [7]. Pour la coloration COX2, les scores négatifs à faibles [1, 2] ou modérés à forts [3, 4] ont été classés comme faibles ou élevés, respectivement [9]. Ici, les expressions NOS2 et COX2 ont également été analysées par coloration fluorescente effectuée sur le Leica Biosystems (Wetzlar, Allemagne) Bond RX Autostainer XL ST5010 à l'aide du kit Bond Polymer Refine (Leica Biosystems DS9800), avec l'omission du réactif Post Primary Block, DAB et Hématoxyline. Après récupération de l'antigène avec EDTA (Bond Epitope Retrieval 2), les coupes ont été incubées pendant 30 min avec COX2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, n° 12282, 1:100), suivi par le réactif Polymer et OPAL Fluorophore 520 (AKOYA, Marlborough, MA). Le complexe d'anticorps COX2 a été dépouillé par chauffage avec Bond Epitope Retrieval 2. Les coupes ont ensuite été incubées pendant 30 min avec l'anticorps NOS2 (Abcam n° ab15323, 1:50), suivi du réactif polymère et du fluorophore OPAL 690. Le complexe d'anticorps NOS2 a été décapées par chauffage avec Bond Epitope Retrieval 2 puis colorées avec CD8 (Abcam n° 101500, 1:100) ou IFNγ (Abcam n° 231036, 1:200), suivi par le réactif Polymer et OPAL Fluorophore 570. Les coupes ont été colorées avec DAPI et couvre-objet avec Prolong Gold Anti-Fade Reagent (Invitrogen). Les images ont été capturées à l'aide du scanner de diapositives entières Aperio ScanScope FL (Leica). L'IHC original précédemment rapporté [7, 9] et les résultats de coloration fluorescente NOS2/COX2 étaient généralement cohérents.

Des tissus fixés au formol inclus en paraffine (FFPE) coupés à 4 μm et montés sur des lames SuperFrost Plus ont été colorés avec un kit FixVUE Immuno-8TM (anciennement appelé kits UltiMapper® (Ultivue Inc., Cambridge, MA), États-Unis ; CD8 , NOS2, COX2, CKSOX10 et cocktail IFNγ) en utilisant la méthode d'immunofluorescence multiplexée (mIF) à code-barres d'ADN conjugué à un anticorps [1]. Ces kits comprennent les tampons et réactifs nécessaires pour exécuter les tests : diluant d'anticorps, mélange de préamplification, enzyme et tampon d'amplification, sondes fluorescentes et tampon correspondant, et réactif de contre-coloration nucléaire. La coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) et au mIF a été réalisée à l'aide de l'Autostainer BOND RX de Leica Biosystems. Avant d'effectuer la coloration mIF, les coupes de tissu FFPE ont été cuites verticalement à 60–65 ° C pendant 30 min pour éliminer l'excès de paraffine avant le chargement sur le BOND RX. Le BOND RX a été utilisé pour colorer les lames avec le protocole recommandé FixVUE (UltiMapper). Lors de la configuration du test, les réactifs du kit ont été préparés et chargés sur l'Autostainer dans des récipients de titrage Leica. Les solutions pour la récupération d'épitopes (ER2, Leica Biosystems cat # AR9640), BOND Wash (Leica Biosystems cat # AR9590), ainsi que tous les autres réactifs en vrac BOND RX ont été achetés auprès de Leica). Au cours de ce test, l'échantillon a d'abord été incubé avec un mélange des quatre conjugués d'anticorps, puis les codes-barres d'ADN de chaque cible ont été simultanément amplifiés pour améliorer la sensibilité du test. Des sondes fluorescentes conjuguées à des codes-barres d'ADN complémentaires ont ensuite été ajoutées à l'échantillon pour lier et marquer les cibles ; Ensuite, une étape d'élimination douce du signal a été utilisée pour éliminer les sondes fluorescentes des marqueurs. Les lames colorées ont été montées dans Prolong Gold Anti-Fade mountant (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, cat # P36965 et recouvertes (Fisherbrand Cover Glass 22 × 40 mm, # 1.5). Les images d'immunofluorescence numérique ont été numérisées à un grossissement de 20 ×. Images ont été co-enregistrés et empilés avec le logiciel Ultivue UltiStacker, puis les images numériques ont été analysées à l'aide de la plateforme d'analyse d'images HALO [41].

Les expériences ont été testées en triple, sauf indication contraire. Le test t de Student a été utilisé pour évaluer la signification statistique à l'aide du logiciel GraphPad Prism (version 9). Les analyses d'image sont rapportées sous forme de moyenne ± SEM et des tests T avec correction de Welch ou de Mann-Whitney ont été utilisés le cas échéant pour déterminer la signification. Des analyses linéaires et des corrélations de Pearson ont également été menées pour déterminer des corrélations significatives entre les expressions protéiques à l'aide du logiciel Prism. La signification est indiquée comme *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001 et ****p ≤ 0,0001. Des analyses de corrélation à cellule unique ont été effectuées dans RStudio à l'aide du corrplot (0, 92) dans R (4.2.1).

Les données RNAseq unicellulaires seront mises à disposition sur demande.

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Ce projet a été financé en tout ou en partie par des fonds fédéraux du programme de recherche intra-muros du NIH, National Cancer Institute, CCR, CIL (RYSC, LAR, ALG, ELF, HR, VS, RJK, SMH, DWM, SKA, SA , et DAW). Ce projet a été financé en partie par des fonds fédéraux du Frederick National Laboratory for Cancer Research, National Institutes of Health, sous contrat HHSN261200800001E (ALW, WFH, MP, SKA et SJL) et Basic Science Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research , Frederick, MD 21702 (SKA). Ce projet a été financé en partie par les subventions 2018/08107-2 et 2021/14642-0 (MCR) de la São Paulo Research Foundation (FAPESP), NIH R01CA238727, NIH U01CA253553 et John S Dunn Research Foundation (STCW), NCI grant no. U54 CA210181, la Breast Cancer Research Foundation (BCRF), la Moran Foundation, Causes for a Cure, le soutien philanthropique de M. Neal et R. Neal, et le Center for Drug Repositioning and Development Program (CREDO) (JCC), Science Foundation Irlande (SFI) subvention numéro 17/CDA/4638, et une subvention SFI et Fonds européen de développement régional (FEDER) numéro 13/RC/2073 (SAG). Nous tenons à remercier la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP) pour l'envoi d'étudiants à l'étranger (LC). Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les opinions ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d'organisations n'implique pas l'approbation du gouvernement américain.

Financement en libre accès fourni par les National Institutes of Health (NIH).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Robert YS Cheng, Lisa A. Ridnour.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Stephen J. Lockett, Stefan Ambs, David A. Wink.

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RYSC et LAR : rédaction d'articles, réalisation d'expériences et analyse de données. ALW : données analysées. ALG, ELF, LC, MP, SMH et SA : réalisation d'expériences et analyse de données. HR, VS et DB : réalisation d'expériences. WFH, EFE, RJK, XL, STCW, DWM, SKA, TRB, SAG, JCC et SJL : analyse des données. MCR : réactifs fournis. DAW : rédaction d'articles et analyse de données.

Correspondance à David A. Wink.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Edité par le Dr Pier Giorgio Mastroberardino

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Réimpressions et autorisations

Cheng, RYS, Ridnour, LA, Wink, AL et al. L'interféron-gamma est la quintessence de l'expression de NOS2 et COX2 dans les tumeurs du sein ER- qui conduisent à de mauvais résultats. Mort cellulaire Dis 14, 319 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

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Reçu : 05 décembre 2022

Révisé : 20 avril 2023

Accepté : 24 avril 2023

Publié: 11 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

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