Stimulation de la thérapie cellulaire adoptive à l'aide d'IL synthétique

Nature volume 607, pages 360–365 (2022)Citer cet article

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La signalisation des récepteurs synthétiques a le potentiel de doter les cellules T transférées de manière adoptive de nouvelles fonctions qui surmontent les principaux obstacles au traitement des tumeurs solides, y compris la nécessité d'une chimiothérapie de conditionnement1,2. Ici, nous avons conçu des récepteurs chimériques qui ont un domaine extracellulaire orthogonal du récepteur IL-2 (ECD) fusionné avec le domaine intracellulaire (ICD) des récepteurs des cytokines communes à chaîne γ (γc) IL-4, IL-7, IL-9 et IL -21 de sorte que la cytokine IL-2 orthogonale déclenche le signal de cytokine γc correspondant. Parmi celles-ci, les cellules T qui signalent via l'IL-2Rβ-ECD-IL-9R-ICD orthogonal chimérique (o9R) se distinguent par l'activation concomitante de STAT1, STAT3 et STAT5 et assument les caractéristiques de la mémoire des cellules souches et des cellules T effectrices. Par rapport aux lymphocytes T o2R, les lymphocytes T o9R ont une efficacité antitumorale supérieure dans deux modèles de tumeurs solides de souris syngéniques récalcitrantes de mélanome et de cancer du pancréas et sont efficaces même en l'absence de lymphodéplétion conditionnante. Par conséquent, en réorientant la signalisation IL-9R à l'aide d'un récepteur de cytokine orthogonal chimère, les cellules T acquièrent de nouvelles fonctions, ce qui se traduit par une activité anti-tumorale améliorée pour les tumeurs solides difficiles à traiter.

Les thérapies qui utilisent des lymphocytes T génétiquement modifiés transférés de manière adoptive ont montré une activité anti-tumorale substantielle chez les patients atteints de malignités hématopoïétiques, mais ont un bénéfice limité chez les patients atteints de tumeurs solides. Une limitation majeure est la faible expansion in vivo et la persistance des lymphocytes T transférés de manière adoptive, ce qui nécessite une chimiothérapie de conditionnement lymphodéplétive, un régime toxique qui limite l'éligibilité des patients. Même les lymphocytes T qui se développent et persistent deviennent différenciés en phase terminale et dysfonctionnels3,4. La signalisation synthétique des récepteurs de cytokines pourrait reprogrammer les cellules T avec un phénotype de type tige qui peut surmonter ces limitations et présenter une activité anti-tumorale améliorée chez les modèles murins et humains5,6. Les manipulations thérapeutiques existantes pour sélectionner ou développer des lymphocytes T de type souche7,8 ne peuvent être utilisées que dans la phase de fabrication des cellules car elles manquent de spécificité pour les cellules transférées de manière adoptive in vivo.

Un récepteur de cytokine orthogonal est une forme mutante du récepteur de cytokine natif qui se lie sélectivement à une forme mutante de la cytokine native. Cela a été démontré avec la paire orthogonale de souris IL-2 cytokine-récepteur (oIL-2 et o2R), qui permet une modulation sélective in vivo des lymphocytes T transférés de manière adoptive pour l'immunothérapie du cancer9. Le récepteur orthogonal de l'IL-2 de souris (o2R) consiste en la chaîne IL-2Rβ avec un ECD modifié qui se lie sélectivement à l'oIL-2, mais pas à l'IL-2 de type sauvage (Fig. 1a). De même, l'oIL-2 ne peut pas se lier au récepteur de l'IL-2 de type sauvage. Pour signaler, à la fois le récepteur orthogonal et le récepteur de l'IL-2 de type sauvage coopèrent avec le yc de type sauvage.

a, Schéma des complexes de récepteurs orthogonaux chimériques de la famille IL-2Rβ de type sauvage, IL-2Rβ orthogonaux ou γc (créés avec Biorender.com). b, histogramme représentatif et quantification de la signalisation pSTAT dans les lymphocytes T exprimant le récepteur chimérique-orthogonal (YFP +) ou non transduits (UTD) stimulés avec MSA-IL-2 (100 nM) (couleur non remplie) ou MSA-oIL-2 (5 μM) (couleur pleine) pendant 20 min. Les données sont présentées sous forme d'intensité de fluorescence moyenne (MFI). c, Courbes dose-réponse de la signalisation pSTAT dans les lymphocytes T transduits YFP + o2R (rouge) ou o9R (bleu) stimulés avec MSA-oIL-2, MSA-IL-2 ou IL-9 pendant 20 min. d–f, Niveaux de marqueurs de surface de CD62L (c), Fas (CD95) (e) et Sca-1 (f) de lymphocytes T exprimant des récepteurs chimériques-orthogonaux cultivés avec MSA-IL-2 (100 nM) ou MSA -oIL-2 (5 μM) pendant deux jours. NS, non significatif ; *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001 (ANOVA). g, Courbes dose-réponse des cellules YFP+ o2R ou o9R ayant subi au moins une division après quatre jours de culture en MSA-oIL-2 ou MSA-IL-2. Les données sont présentées sous forme de pourcentage divisé. Les données sont moyennes ± sem avec n = 3 répétitions biologiques, sauf indication contraire.

Données source

En utilisant la nature modulaire du système oIL-2, nous avons souhaité étudier le potentiel thérapeutique d'autres membres de la famille des récepteurs de cytokines γc10,11,12. En remplaçant l'ICD d'o2R par l'ICD des récepteurs des cytokines γc IL-4, IL-7, IL-9 et IL-21, nous avons créé des récepteurs orthogonaux chimériques qui contiennent l'ECD liant l'oIL-2 de souris fusionné à l'ICD de chaque récepteur de la famille des cytokines γc (Fig. 1a et Tableau supplémentaire 1). Pour nos études, nous avons sélectionné le clone 3A10 de l'oIL-2 comme ligand du récepteur en raison de son orthogonalité supérieure9.

La stimulation des récepteurs orthogonaux chimériques avec l'oIL-2 liée à l'albumine sérique de souris (MSA-oIL-2, clone 3A10 ; tableau supplémentaire 2) a entraîné des schémas de signalisation phospho-STAT compatibles avec la signalisation connue via chaque cytokine γc respective10,13 ( Fig. 1b et données étendues Fig. 1a). La signalisation via o9R a entraîné une puissante phosphorylation de STAT1, STAT3 et STAT5 - un profil distinct qui est cohérent avec la signalisation connue via le récepteur IL-9 de type sauvage14 (Fig. 1b et Extended Data Fig. 1a). La signalisation o9R était dose-dépendante et spécifique à MSA-oIL-2 (Fig. 1c). De plus, l'expression de o2R ou o9R n'a pas affecté la signalisation STAT induite par l'IL-2 de type sauvage (Extended Data Fig. 1b).

L'IL-9R est un membre moins étudié de la famille des récepteurs de cytokines γc qui est naturellement exprimé par les mastocytes, les cellules B mémoire, les cellules lymphoïdes innées et les progéniteurs hématopoïétiques13,15,16,17,18,19,20. Bien que des sous-ensembles de lymphocytes T qui produisent de l'IL-9 aient été décrits21,22,23,24,25, les effets de la signalisation IL-9R sur les lymphocytes T ne sont pas bien caractérisés26,27,28,29,30,31. Par exemple, les cellules T naïves sont insensibles à l'IL-9 et le développement des cellules T n'est pas altéré chez les souris déficientes en IL-9, ce qui suggère que l'IL-9 n'est pas une cytokine naturelle critique dans la biologie des cellules T18,29,32. Nous avons constaté que les cellules T de souris activées ne supportaient pas la signalisation IL-9 (Fig. 1c) en raison de l'absence d'expression de l'IL-9R (Extended Data Fig. 1c, d), ce qui souligne la non-orthodoxie de la signalisation o9R dans ces cellules27,33. ,34. La signalisation o9R est un imitateur authentique de la signalisation IL-9R de type sauvage, car le traitement par IL-9 des cellules T de souris transduites avec l'IL-9R de type sauvage a entraîné un schéma similaire de phosphorylation de STAT1, STAT3 et STAT5 (Extended Data Fig. .1e).

Comme les cellules o9R et l'IL-2Rβ de type sauvage utilisent toutes deux la signalisation γc, nous avons évalué la compétition entre la signalisation native et orthogonale. La co-exposition à des doses saturantes de MSA-oIL-2 n'a pas affecté le pic de phosphorylation de STAT5 par MSA-IL-2 dans les cellules T o9R (données étendues Fig. 2a). Et bien que des doses croissantes de MSA-IL-2 atténuent partiellement l'induction par MSA-oIL-2 de pSTAT1 et pSTAT3 dans les cellules T o9R, probablement en raison de la puissance plus faible du clone MSA-oIL-2 3A10, le programme de signalisation des cellules T o9R est resté actif (données étendues Fig. 2b, c).

Nous avons observé que les cellules T signalant via o9R (ainsi que o21R) s'enrichissaient pour une population CD62L + et une expression plus élevée de Fas (CD95) et Sca-1 compatible avec un phénotype TSCM, un sous-ensemble connu pour son activité anti-tumorale supérieure dans les cellules adoptives. (ACT)6,35,36,37 (Fig. 1d–f). Les cellules T o9R ont également proliféré moins que les cellules T exprimant o2R (Fig. 1g et données étendues Fig. 3a, b). Parmi les récepteurs orthogonaux, seul o21R a entraîné moins de prolifération que o9R (Extended Data Fig. 3a).

Compte tenu du profil de signalisation STAT unique, de son statut moins connu au sein de la famille des récepteurs de cytokines γc et de l'acquisition de caractéristiques des cellules T mémoire des cellules souches (TSCM), nous avons choisi d'étudier l'effet de la signalisation o9R in vivo à l'aide de modèles murins d'ACT pour tumeurs solides. Nous avons d'abord utilisé des lymphocytes T de souris pmel transgéniques, qui expriment un récepteur endogène des lymphocytes T (TCR) spécifique de la gp100, un antigène mélanocytaire surexprimé dans le mélanome B1638. Nous avons modifié le protocole pour qu'il soit plus strict et avons omis la radiothérapie lymphodéplétive, un régime de conditionnement qui potentialise l'ACT en induisant la prolifération homéostatique des cellules T transférées de manière adoptive par la signalisation des cytokines γc39 (Fig. 2a). Le profil de signalisation STAT et la prolifération des lymphocytes T o2R et o9R pmel reflétaient ceux des lymphocytes T o2R et o9R des souris C57BL / 6 (données étendues Fig. 4a, b).

a, schématique. Des souris porteuses de mélanome B16-F10 ont subi une ACT et un traitement avec MSA-IL-2 ou MSA-oIL-2 (2,5 × 104 unités par jour, intrapéritonéale) pendant 5 jours. Les souris n'étaient pas lymphodéplétées sauf indication contraire. TBI, irradiation corporelle totale. b, quantification du sang périphérique des lymphocytes T pmel sept jours après ACT (n = 6 souris par groupe, sauf indication contraire dans les méthodes). **P < 0,01 (test t non apparié). c, d, croissance tumorale (moyenne ± sem, n = 6 souris par groupe, sauf indication contraire dans les méthodes) après traitement avec ACT et MSA-IL-2 ou MSA-oIL-2. **P < 0,01 (ANOVA). e, Survie des souris traitées avec des lymphocytes T pmel et MSA-IL-2 ou MSA-oIL-2 pendant les durées indiquées. NS, non significatif ; **P < 0,01 (test du log-rank). f, Quantification des lymphocytes T o2R ou o9R pmel infiltrant la tumeur cinq jours après ACT chez des souris traitées avec MSA-oIL-2 (n = 5 souris par groupe). *P < 0,05 (test t non apparié). g, Croissance in vitro de cellules tumorales nRFP + B16-F10 co-cultivées avec des cellules T pmel (rapport effecteur: cible (E: T) 2: 1) prétraitées avec MSA-oIL-2 (5 μM). **P < 0,01 (ANOVA). h, regroupement opt-SNE de cellules T pmel o2R et o9R traitées avec MSA-oIL-2 (5 μM) pendant 48 h in vitro (à gauche), avec des parcelles séparées par groupe montrant des grappes différentiellement abondantes (au milieu), et un volcan annoté tracé (à droite). i, cartes thermiques de gènes conservés manuellement associés à la souche et au dysfonctionnement des cellules T (à gauche) et à l'activation et à la fonction effectrice (à droite), et exprimés de manière différentielle entre les cellules T o2R et o9R pmel (de la Fig. 3h) traitées avec MSA-oIL-2 (5 μM). Les groupes traités par MSA-IL-2 (50 nM) sont également présentés. j, Tracé du score d'enrichissement normalisé (NES) (à gauche) des ensembles de gènes du facteur de transcription comparant les cellules T pmel o2R et o9R traitées avec MSA-oIL-2 (de la Fig. 3h). Enrichissement significatif en rouge (P ajusté < 0,05, test de Fisher bilatéral avec formule hypergéométrique). À droite, rapport de l'expression de Jun à Fos. **P < 0,01 (test t non apparié). Les données sont moyennes ± écart-type avec n = 3 répétitions biologiques, sauf indication contraire.

Données source

Bien que les cellules T o2R et o9R pmel se soient développées en l'absence de lymphodéplétion (Fig. 2b), nous avons observé des effets anti-tumoraux plus cohérents et une survie prolongée dans ce modèle avec des cellules T o9R pmel traitées avec MSA-oIL-2 (Fig. 2c , d et données étendues Fig. 5a, b), obtenant des effets anti-tumoraux comparables aux lymphocytes T pmel chez des souris lymphodéplétées. Et bien que les cellules T conçues pour sécréter des cytokines natives puissent également éviter le besoin de lymphodéplétion40,41, les cytokines natives (contrairement à la signalisation orthogonale des cytokines) induisent une signalisation dans les cellules transférées de manière adoptive et endogènes. L'efficacité anti-tumorale supérieure des lymphocytes T o9R pmel a également été observée chez des souris lymphodéplétées qui ont été traitées avec MSA-oIL-2 (Extended Data Fig. 5c).

Comme le clone 3A10 de MSA-oIL-2 est hautement orthogonal et n'affecte pas les cellules endogènes, nous avons émis l'hypothèse que les souris toléreraient un schéma posologique prolongé de 25 jours, alors que les effets toxiques de MSA-IL-2 sont observés après 5 jours9. Nous n'avons pas observé de toxicité clinique avec le schéma posologique prolongé, ce qui a entraîné un contrôle tumoral et une survie supérieurs avec des régressions complètes chez quatre des six souris porteuses de tumeur B16 (Fig. 2e et Données étendues Fig. 5d), dépassant les résultats chez les souris lymphodéplétées. traité avec pmel ACT et cinq jours de MSA-IL-2.

Ces résultats, malgré l'effet prolifératif plus faible de la signalisation o9R, suggèrent que des facteurs autres que l'expansion sélective sous-tendent ses effets anti-tumoraux accrus. Nous avons observé une plus grande infiltration tumorale par les cellules T o9R pmel par rapport aux cellules T o2R pmel cinq jours après l'ACT chez des souris traitées avec MSA-oIL-2 (Fig. 2f et Extended Data Fig. 5g). Parmi 18 groupes de population de leucocytes CD45 + infiltrant la tumeur, le trait distinctif dominant était la présence de cellules T o9R contre o2R pmel (8, 9% contre 1, 6% de cellules CD45 + infiltrant la tumeur; Données étendues Fig. 5e). Par rapport aux cellules T pmel infiltrant la tumeur o2R, les cellules T pmel o9R ont été enrichies pour les clusters associés à l'activation des cellules T, y compris un cluster co-exprimant CD39, PD-1 et TBET (Extended Data Fig. 5f). En plus d'une meilleure infiltration tumorale, les cellules T o9R pmel ont montré une capacité cytolytique in vitro plus élevée et une production accrue d'IFNγ par rapport à leurs homologues o2R (Fig. 2g et Extended Data Fig. 5h, i).

Nous avons ensuite étudié le programme biologique responsable de l'amélioration de l'infiltration, de la fonction effectrice et de l'efficacité in vivo des lymphocytes T o9R pmel. L'exposition in vitro à MSA-oIL-2 a entraîné des phénotypes nettement divergents par cytométrie de masse de haute dimension ; 8 des 14 grappes étaient différentiellement abondantes entre les cellules T pmel o2R et o9R (Fig. 2h). Les cellules T o9R pmel ont acquis des marqueurs d'un phénotype TSCM (Sca-1, CD127, Fas et CD62L), reflétant les effets phénotypiques de la signalisation IL-9R de type sauvage (Fig. 2h et données étendues Fig. 6a). Ces caractéristiques TSCM faisaient partie des changements transcriptomiques bidirectionnels globaux observés par séquençage d'ARN (ARN-seq) dans une population en vrac de cellules T pmel (Extended Data Fig. 6b). Cependant, les changements induits par o9R s'étendent au-delà de l'acquisition d'un phénotype TSCM ; nous avons également observé l'enrichissement simultané de gènes classiquement associés à l'activation des lymphocytes T (Pdcd1, Icos, Entpd1, Lag3 et Havcr2) et à la fonction effectrice (Ifng, Gzma et Prf1), qui sont traditionnellement exclus du phénotype TSCM (Fig. 2i). Cela peut représenter un phénotype hybride ou la présence simultanée de sous-populations hétérogènes uniques à la signalisation o9R ou IL-9R native dans les cellules T. Il a été rapporté que l'induction de la granzyme A par l'activation de l'IL-9R dépendait de l'activation concomitante de STAT1 et STAT3, une caractéristique de la signalisation o9R qui est distincte de la signalisation o2R, o4R, o7R et o21R14.

Une analyse transcriptomique de l'enrichissement de la voie du facteur de transcription a révélé un enrichissement significatif des gènes associés au facteur de transcription AP-1 JUN, en plus des facteurs de transcription attendus STAT1 et STAT3 (Fig. 2j). Cela s'est accompagné d'une augmentation du rapport d'expression de Jun à Fos, une caractéristique des cellules T spécifiques de la tumeur qui résistent à l'épuisement induit par la tumeur42. En parallèle, o9R signalant des gènes régulés à la baisse qui sont associés au dysfonctionnement des lymphocytes T, notamment Nr4a1 et Tox (réfs. 43, 44, 45, 46 ; Fig. 2i).

Pour examiner l'activité in vivo de la signalisation o9R, nous avons examiné l'expression de CD62L dans des lymphocytes T pmel transférés de manière adoptive. L'expression de CD62L était plus élevée dans les cellules T o9R que dans les cellules T pmel o2R dans les ganglions lymphatiques drainants et la rate de souris porteuses de tumeurs traitées avec MSA-oIL-2 (données étendues Fig. 6c). Aucune différence n'a été observée intratumorale, dans laquelle l'activation des lymphocytes T spécifiques de l'antigène est susceptible de prédominer.

Pour étudier la signalisation o9R dans le contexte de l'ACT basé sur le récepteur d'antigène chimérique (CAR), nous avons utilisé un modèle résistant à l'immunothérapie du cancer du pancréas exprimant la mésothéline. En tant que source d'oIL-2 pour les études sur les cellules CAR T, nous avons choisi l'administration intratumorale vectorielle (Fig. 3a) pour assurer des concentrations élevées d'oIL-2 (clone 3A10) dans la tumeur et pour évaluer l'effet de la signalisation o9R sur le dysfonctionnement des cellules T. dans le microenvironnement tumoral. Ce modèle a fourni un contraste avec les études pmel, dans lesquelles la signalisation o9R était la plus active dans les tissus périphériques.

a, en haut, schématique d'un vecteur adénoviral codant pour l'oIL-2 (Ad-oIL-2) sous le promoteur du cytomégalovirus (CMV). LITR, répétition terminale inversée gauche ; RITR, répétition terminale inversée droite. En bas à gauche, expression in vitro de oIL-2 à Ad-oIL-2 dans des surnageants de culture cellulaire. mIL-2, IL-2 de souris. En bas à droite, quantification de l'oIL-2 dans les homogénats tumoraux et les sérums 72 h après injection intratumorale (IT) de 109 particules virales (VP) d'Ad-oIL-2, ou injection intrapéritonéale (IP) quotidienne de 2,5 × 104 unités MSA-oIL -2 (n = 5 souris par groupe). b, analyse Western blot représentative de l'expression de pSTAT1, pSTAT3 et pSTAT5 dans les cellules T 30 min après stimulation avec MSA-IL-2 (100 nM) ou MSA-oIL-2 (5 μM). Pour les données de source de gel, voir Supplémentaire Fig. 1. c, Élimination in vitro des lymphocytes T de PDA7940b positif à la mésothéline (rapport E: T 2: 1) pré-incubé avec MSA-oIL-2 (5 μM) (moyenne ± sd, n = 4 par groupe). d–f, expression de surface représentative de CD44 et CD62L (d), expression de Fas (CD95) (e) et cytokines sécrétées (f) dans des cultures de cellules T CAR-o2R ou CAR-o9R après quatre jours de stimulation avec MSA- IL-2 (100 nM) ou MSA-oIL-2 (5 μM). ****P < 0,0001 (ANOVA). g, Cartes thermiques des gènes associés à la souche et au dysfonctionnement des cellules T (à gauche) et à l'activation et à la fonction effectrice (à droite), et exprimés de manière différentielle entre les cellules o2R et o9R CAR T traitées avec MSA-oIL-2. h, Schéma du modèle ACT syngénique utilisant des tumeurs PDA7940b (créé avec Biorender.com). Dose d'Ad-oIL-2, 109 VP. Dose de cellules CAR T, 5 × 106 cellules. Dose de cyclophosphamide (CTX), 120 mg kg-1. IV, intraveineux ; précond., préconditionnement ; SC, sous-cutané. i,j, Courbes de croissance individuelles des tumeurs PDA7940b (n = 12 souris par groupe), avec (i) et sans (j) conditionnement de CTX. Les lignes noires indiquent les décès dus à l'ICANS. n = 12 souris par groupe. RC, réponse complète ; Tox, décès dus à la neurotoxicité. NS, non significatif ; ****P < 0,0001 (ANOVA). k, Quantification des cellules CAR T infiltrant la tumeur (en haut) et fréquence des cellules CAR T infiltrant la tumeur positives à l'IFNγ (en bas) au jour 9 chez les souris traitées avec CTX. *P < 0,05, ****P < 0,0001 (ANOVA). Les données sont moyennes ± sem avec n = 3 répétitions biologiques, sauf indication contraire.

Données source

Nous avons transduit des cellules T primaires de souris avec des rétrovirus qui codent pour un CAR de mésothéline anti-souris de deuxième génération avec des récepteurs orthogonaux pour générer des cellules T CAR-o2R et CAR-o9R (Extended Data Fig. 7a, b). La stimulation des cellules T CAR-o9R et CAR-o2R avec MSA-oIL-2 a reproduit les profils de phosphorylation et de prolifération STAT de la signalisation o9R et o2R observés sur les Fig. 1 et 2 (Fig. 3b et données étendues Fig. 7c). Malgré leur désavantage prolifératif, les cellules CAR-o9R ont montré une efficacité anti-tumorale supérieure in vitro contre la lignée cellulaire d'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDA) positive à la mésothéline PDA7940b (Fig. 3c).

Semblable au modèle pmel, les cellules CAR-o9R ont été caractérisées par un phénotype TSCM après stimulation avec MSA-oIL-2 (Fig. 3d, e et Extended Data Fig. 7d). Les cellules T CAR-o9R sécrètent également des niveaux plus élevés d'IFNγ, TNF, IL-4, IL-9, IL-10, IL-18, IL-22 et IL-23 que les cellules CAR-o2R en réponse à oIL-2 (Fig. 3f), reflétant la signature transcriptomique complexe des lymphocytes T o9R pmel. Ceci a été validé au niveau transcriptomique ; les gènes associés aux fonctions effectrices (Ifng, Prf1, Gzmb et Gzma) et à l'activation des lymphocytes T (Pdcd1, Icos et Entpd1) ont été régulés à la hausse dans les cellules CAR-o9R, ainsi qu'un changement vers la souche (régulation à la hausse de Il7r, Sell et Bcl6 et régulation à la baisse de Eomes et Tox1 ; Fig. 3g).

Dans un modèle récalcitrant de PDA utilisant des tumeurs sous-cutanées PD7940b établies, le traitement soit avec un vecteur adénoviral codant pour oIL-2 (Ad-oIL-2) soit avec CAR-o2R ou CAR-o9R était inefficace pour contrôler les tumeurs à croissance rapide (Fig. 3h et Données étendues Fig. 7e). Cependant, la thérapie combinée avec Ad-oIL-2 plus CAR-o2R ou Ad-oIL-2 plus CAR-o9R a entraîné des régressions complètes chez 8 des 12 souris (67 %) et 6 des 12 souris (50 %), respectivement (Fig. .3i). Une toxicité précoce a été observée dans le groupe Ad-oIL-2 plus CAR-o9R, car 40 % des souris (5 sur 12) sont mortes au jour 10, mais - notamment - moins de rechutes tumorales ont été observées chez les souris survivantes du groupe Ad-oIL- 2 plus groupe CAR-o9R (1 sur 7) par rapport au groupe Ad-oIL-2 plus CAR-o2R (4 sur 12).

La toxicité de Ad-oIL-2 plus CAR-o9R chez des souris lymphodéplétées a été caractérisée par des signes cliniques (tremblements, délire et convulsions) du syndrome de neurotoxicité immuno-effecteur-associé aux cellules (ICANS). Une analyse d'hybridation in situ d'ARN (ARN ISH) de souris avec ICANS a révélé que les cellules CAR T s'infiltraient dans les couches méningées du cerveau, où des cellules méningées exprimant la mésothéline étaient également détectées (Extended Data Fig. 8a, b). Significativement plus de cellules CAR T infiltrant les méninges ont été observées dans le groupe Ad-oIL-2 plus CAR-o9R par rapport au groupe Ad-oIL-2 plus CAR-o2R, ce qui suggère une association entre l'activité hors tumeur ciblée et dirigée par CAR et l'ICANS observé (Extended Data Fig. 8c). Cela s'est accompagné d'une expression plus élevée de la mésothéline, qui peut survenir dans le contexte d'un stimulus inflammatoire (Extended Data Fig. 8d). Les analyses sériques n'ont pas montré de signes de syndrome de libération de cytokines ou de syndrome de lyse tumorale (données étendues Fig. 8e, f). L'examen histologique du cerveau de trois souris survivantes à long terme qui ont été traitées avec Ad-oIL-2 plus CAR-o9R était sans particularité, y compris des leptoméninges normales sans cellules inflammatoires (Extended Data Fig. 8g). Sur la base de ces résultats et de l'absence de toxicités similaires dans le modèle pmel, l'ICANS observé semble être spécifique à la spécificité CAR et non inhérent aux cellules T o9R. Néanmoins, la traduction clinique de l'o9R doit tenir compte de la toxicité hors tumeur potentielle ajoutée sur la cible et peut nécessiter des stratégies d'ingénierie (par exemple, des systèmes marche/arrêt et des circuits synthétiques) pour maximiser la sécurité des patients.

En l'absence de chimiothérapie de conditionnement, la supériorité du régime Ad-oIL-2 (3A10) plus CAR-o9R sur Ad-oIL-2 (3A10) plus CAR-o2R était plus évidente, comme le suggèrent des taux de régression complète de 42 % (5 sur 12) et 8,3 % (1 sur 12), respectivement (Fig. 3j), ainsi que par une survie prolongée (Extended Data Fig. 9a), car seulement 1 souris sur 12 dans l'Ad-oIL-2 plus CAR Le groupe -o9R a présenté une toxicité en l'absence de conditionnement. L'efficacité dépendait à la fois de l'expression orthogonale des récepteurs dans les cellules T et de l'expression de l'oIL-2 via Ad-oIL-2 (données étendues Fig. 9b, c).

Nous avons examiné l'effet de l'Ad-oIL-2 sur la quantité et la qualité des cellules T CAR-o9R ou CAR-o2R infiltrant la tumeur. Contrairement au modèle pmel, moins de cellules T CAR-o9R que CAR-o2R ont été observées dans la tumeur huit jours après l'ACT (Fig. 3k). Les comparaisons entre les modèles doivent être faites avec prudence, compte tenu des différences entre la signalisation CAR et TCR et entre la distribution restreinte aux tumeurs et la distribution systémique des cytokines. Néanmoins, la fréquence plus élevée de cellules CAR-o9R intratumorales exprimant l'IFNγ (Fig. 3k) et la cytotoxicité directe in vitro supérieure des cellules CAR-o9R (Fig. 3c) indiquent qu'une puissance intratumorale supérieure - plutôt qu'une infiltration ou une prolifération tumorale - entraîne la efficacité anti-tumorale des cellules T CAR-o9R dans le contexte de la signalisation orthogonale des cytokines restreinte à la tumeur. En revanche, l'administration systémique d'oIL-2 dans le modèle pmel a entraîné une signalisation périphérique o9R (Extended Data Fig. 6c), ce qui peut expliquer le trafic accru de cellules T o9R pmel. La signalisation périphérique o9R peut également faciliter les interactions entre les cellules T transférées de manière adoptive et les cellules endogènes (par exemple, les cellules présentatrices d'antigène) qui aident à maintenir les effets anti-tumoraux.

Pour évaluer le potentiel de traduction de la signalisation o9R, nous avons généré de l'IL-2Rβ orthogonal humain (ho2R) et de l'IL-2Rβ – IL-9R chimérique orthogonal humain (ho9R) (tableau supplémentaire 3). Des cellules T humaines ont été transduites par voie rétrovirale avec des vecteurs codant pour ho2R ou ho9R (chacun contenant YFP), ainsi qu'un vecteur codant pour un TCR spécifique de NY-ESO-1 dans le contexte de HLA*0201 (NYESO1-TCR clone 1G4) (réf. . 47). NY-ESO-1 est un antigène du cancer du testicule qui est surexprimé dans le sarcome synovial, le liposarcome myxoïde, le mélanome et d'autres tumeurs. Les cellules T transduites et triées (Extended Data Fig. 10a) ont été exposées à de l'IL-2 orthogonale humaine liée à la MSA (MSA-hoIL-2, qui contient des substitutions d'acides aminés SQVLKA aux positions 15, 16, 19, 20, 22 et 23 relatives au polypeptide natif ; tableau supplémentaire 4) ou IL-2 de type sauvage (MSA-hIL-2)48,49. Conformément aux observations dans le système de la souris, la signalisation via ho9R active la signalisation pSTAT1, pSTAT3 et pSTAT5 (Fig. 4a). De même, la signalisation native de l'IL-2-STAT5 via le γc endogène n'est pas perturbée par l'expression orthogonale du récepteur (Extended Data Fig. 10b). Enfin, MSA-hoIL-2 est hautement orthogonal et n'active pas les cellules non transduites ; cependant, la MSA-hIL-2 de type sauvage active le récepteur orthogonal à des concentrations élevées (Extended Data Fig. 10b).

a, signalisation pSTAT dans des lymphocytes T TCR NY-ESO-1 humains co-exprimant ho2R ou ho9R et stimulés avec MSA-hoIL-2 pendant 20 min. b, repliement des cellules T traitées avec MSA-hoIL-2 (1 μM) ou MSA-hIL-2 (0, 1 μM) (moyenne ± sd ; n = 3 par groupe). ***P < 0,001 (test t non apparié au jour 6). c, pourcentage de cellules CD45RA + CD27 + CD95 + CCR7 + TSCM après six jours de culture avec MSA-hoIL-2 (1 μM) (moyenne ± sd ; n = 3 par groupe). ****P < 0,0001 (test t non apparié). d, Pliez l'expansion des cellules TSCM et TCM avec MSA-hoIL-2 (1 μM) ou MSA-hIL-2 (0,1 μM), par rapport au jour 2. *P < 0,05, **P < 0,01 (test t non apparié ); n = 3 par groupe. e, les cellules T ont été co-cultivées à un rapport E:T de 1: 1 avec la lignée cellulaire de mélanome HLA * 0201 + NY-ESO-1 + (nRFP-M407) et MSA-hoIL-2 (1 μM). Des cellules tumorales (105) ont été réintroduites toutes les 72 h (flèches bleues) en présence de MSA-hoIL-2 (1 μM). Montré est le pourcentage de confluence tumorale (moyenne ± sd ; n = 3 par groupe). f, pourcentage de cellules CD45RA + CD27 + et TSCM, aux côtés de CD62L et CXCR3 MFI (porte YFP +) après la quatrième provocation tumorale (de e). g, les cellules T après la quatrième provocation tumorale (de e) ont été restimulées avec des anticorps anti-CD3 ou anti-CD28, M407 (HLA*0201+NY-ESO-1+) ou M263 (HLA*0201−NY-ESO-1 −). L'IFNγ, le TNF et l'IL-2 ont été quantifiés parmi les lymphocytes T CD8 + YFP + par coloration intracellulaire des cytokines (ICS) (moyenne ± sd ; n = 3 par groupe). NS, non significatif ; ****P < 0,0001 (ANOVA à deux facteurs). Les graphiques en anneau indiquent la proportion de lymphocytes T CD8+YFP+ dans chaque groupe exprimant 0/3, 1/3, 2/3 ou 3/3 des cytokines. h, des cellules T triées co-exprimant ho2R ou ho9R et anti-mésothéline M5 CAR ont été co-cultivées à un rapport E: T de 1: 1 avec des cellules AsPC-1 PDA en présence de MSA-hoIL-2 (1 μM) tous les 48 h. À gauche, viabilité tumorale mesurée en tant qu'indice cellulaire normalisé (moyenne ± sem ; n = 3 par groupe). À droite, après la dernière provocation tumorale, les marqueurs de surface des lymphocytes T ont été caractérisés. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ; NS, non significatif (ANOVA à deux voies pour la destruction des cellules tumorales ; test t non apparié pour l'analyse phénotypique).

Données source

Semblable au système de la souris, malgré le signal prolifératif plus faible de la signalisation ho9R (Fig. 4b), nous avons observé une expansion de TSCM (CD45RA + CD27 + CCR7 + CD95 +) et de la mémoire centrale T (TCM; CD45RA-CD27 + CCR7 + CD95 +) cellules par enrichissement et quantité absolue parmi les cellules T ho9R – NYESO1-TCR après deux et six jours de culture avec MSA-hoIL-2 (Fig. 4c, d et Extended Data Fig. 10c, d, e). Cette différence de phénotype des cellules T entre les cellules T ho9R – NYESO1-TCR et ho2R – NYESO1-TCR a persisté même après quatre provocations spécifiques à l'antigène avec une lignée cellulaire de mélanome HLA * 0201 + NY-ESO-1 +, nRFP-M407, dans le présence de MSA-hoIL-2 (Fig. 4e, f). Comparées aux cellules T ho2R – NYESO1, les cellules T ho9R – NYESO1 ont conservé une plus grande fréquence de cellules CD45RA + CD27 + et TSCM et ont exprimé des niveaux plus élevés de CD62L et CXCR3. Les cellules T ho9R – NYESO1 stimulées de manière répétitive exprimaient plus d'IFNγ, de TNF et d'IL-2 et présentaient une plus grande polyfonctionnalité lorsqu'elles étaient exposées à des billes activatrices CD3 / CD28 ou à la lignée cellulaire de mélanome apparentée nRFP-M407 (Fig. 4g et Données étendues Fig. 10f). Dans un modèle d'exposition continue à l'antigène50 utilisant des cellules T humaines qui co-expriment un CAR spécifique de la mésothéline (M5) et ho2R ou ho9R, la signalisation via ho9R a entraîné une destruction supérieure des cellules tumorales après des provocations tumorales répétitives, avec un enrichissement en CD45RA + CD27 + Cellules T avec une expression CCR7 plus élevée, similaires aux cellules T ho9R – NYESO1 (Fig. 4h et Extended Data Fig. 10g).

En conclusion, la plate-forme orthogonale IL-2 cytokine-récepteur permet la redirection de la signalisation par le remplacement modulaire du DCI orthogonal IL-2Rβ par les DCI des récepteurs d'autres cytokines γc. Notamment, la stimulation spécifique in vivo de la signalisation o9R dans les lymphocytes T spécifiques des tumeurs à base de TCR et de CAR par le ligand orthogonal 3A10 de l'IL-2 entraîne une amélioration de l'activité antitumorale dans deux modèles de tumeurs solides réfractaires à l'immunothérapie et conserve une robustesse activité dans un cadre plus rigoureux sans conditionner la lymphodéplétion. Cet avantage est médié en tirant parti des cytokines γc pour rediriger le message de signalisation IL-2 via le DCI IL-9Rα, ce qui entraîne l'activation concomitante de STAT1, STAT3 et STAT5. Transmis dans les lymphocytes T, le message de signalisation de l'IL-9Rα se traduit par un phénotype unique qui fusionne les caractéristiques fonctionnelles bénéfiques de la mémoire des cellules souches et des lymphocytes T effecteurs, pour fournir une activité anti-tumorale in vivo améliorée.

L'ADN codant pour l'IL-2 de type sauvage et orthogonal de souris et d'humain et l'IL-9 de type sauvage a été cloné dans le vecteur d'expression d'insecte pAcGP67-A, qui comprend une étiquette C-terminale 8 × His pour la purification par affinité. L'ADN codant pour l'albumine de sérum de souris (MSA) a été acheté auprès d'Integrated DNA Technologies (IDT) et cloné dans pAcGP67-A en tant que fusion N-terminale. Les constructions d'ADN d'expression d'insectes ont été transfectées dans des cellules de Trichoplusia ni (High Five) (Invitrogen) à l'aide du système d'expression de baculovirus BaculoGold (BD Biosciences) pour la sécrétion et purifiées à partir du surnageant clarifié par Ni-NTA suivi d'une chromatographie d'exclusion de taille avec un Superdex-200 colonne et formulée dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour injection. L'endotoxine a été éliminée à l'aide du kit de colonne Proteus NoEndo HC Spin conformément aux recommandations du fabricant (VivaProducts) et l'élimination de l'endotoxine a été confirmée à l'aide du kit de quantification d'endotoxine chromogène Pierce LAL (Thermo Fisher Scientific). Les protéines ont été concentrées et stockées à -80 ° C jusqu'à ce qu'elles soient prêtes à l'emploi.

L'ADNc codant pour l'IL-2Rβ orthogonal de souris et l'ADNc de blocs de gènes codant pour les ICD de souris d'IL-4R, IL-7R, IL-9R et IL-21R (IDT) ont été clonés dans le vecteur rétroviral pMSCV-MCS-IRES-YFP par PCR et assemblage isotherme (ITA). L'IL-2Rβ orthogonal humain (ho2R) et l'IL-2Rβ-ECD-IL-9R-ICD orthogonal chimère (ho9R) ont été clonés de manière similaire dans le vecteur pMSCV.

Les souris ont été hébergées dans des animaleries approuvées par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins de laboratoire et utilisées selon des protocoles approuvés par l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l'Université de Californie à Los Angeles (UCLA), de l'Université de Pennsylvanie et Université de Stanford. Pour les expériences menées à l'UCLA, des souris C57BL/6J ont été élevées et conservées dans le vivarium de radio-oncologie ; Des souris transgéniques pmel-1 TCR/Thy1.1 (souris pmel) sur fond C57BL/6 ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory. Pour les expériences menées à l'Université de Pennsylvanie, des souris C57BL/6J et B6 CD45.1 'Pepboy' ont été achetées auprès du Jackson Laboratory. Pour les expériences menées à l'Université de Stanford, des souris C57BL/6J ont été achetées auprès du Jackson Laboratory.

La lignée cellulaire de mélanome de souris B16-F10 a été achetée auprès de l'ATCC et cultivée avec du RPMI 1640 avec de la l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Omega Scientific), de la pénicilline (100 U ml-1, Omega Scientific) , streptomycine (100 μg ml-1, Omega Scientific) et amphotéricine B (0,25 μg ml-1, Omega Scientific). La lignée cellulaire de cancer du pancréas de souris, dérivée de tumeurs spontanées survenant chez des souris KPC (LSL-KrasG12D/+ ;LSL-Trp53R172H/+ ;Pdx-1-Cre), a été maintenue dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline -streptomycine. Les lignées cellulaires de mélanome humain M407 et M263 ont été établies à partir de biopsies de patients sous l'approbation UCLA IRB 11-003254 et maintenues dans un milieu RPMI 1640 additionné de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline-streptomycine ; Les cellules M407 ont été transduites de manière stable pour exprimer la RFP nucléaire (nRFP) pour une utilisation dans un test d'imagerie de cellules vivantes51. Des cellules T dérivées de souris transgéniques C57BL/6 ou pmel ont été cultivées dans du RPMI 1640 avec de la l-glutamine additionnée de 10 % d'Hyclone FBS (Cytiva), d'antibiotiques, de 50 μM de 2-mercaptoéthanol (Gibco), d'acides aminés non essentiels à 1 %, de 1 % pyruvate de sodium et HEPES. Des lymphocytes T humains primaires ont été cultivés de manière similaire, sauf sans 2-mercaptoéthanol. Les cellules HEK293T ont été achetées auprès de l'ATCC et maintenues dans du DMEM additionné de 10% de FBS, de 1 × GlutaMax (Gibco) et de pénicilline-streptomycine. Les lignées cellulaires ont été périodiquement authentifiées et également périodiquement testées pour l'infection par les mycoplasmes à l'aide d'un kit de détection des mycoplasmes (Biotool).

La production de rétrovirus codant pour des récepteurs orthogonaux de cytokines a déjà été décrite9. En bref, les cellules HEK293T ont été ensemencées à 3 × 106 cellules par boîte de culture tissulaire de 10 cm et laissées adhérer pendant la nuit. Les cellules ont été transfectées avec un rapport de 1,5: 1 de vecteur rétroviral pMSCV à un vecteur d'emballage pCL-Eco en utilisant X-tremeGENE HP (Roche), Turbofect (Thermo Fisher Scientific) ou TransIT Reagent (Thermo Fisher Scientific) et cultivées pendant une nuit dans du DMEM avec 5 % FBS. Après 24 h, le milieu a été remplacé par du DMEM frais avec 5 % de FBS et cultivé pendant 24 h supplémentaires. Le milieu a été récupéré, clarifié par centrifugation et surgelé dans de l'azote liquide pour stockage à -80 °C. Les cellules ont été reconstituées avec du DMEM frais avec 5% de FBS et cultivées pendant 24 heures supplémentaires, et le surnageant rétroviral a été collecté et stocké comme décrit. Pour générer des rétrovirus pour la transduction de pmel et de lymphocytes T humains, la même procédure a été utilisée avec les variantes suivantes : 18 h après la transfection, le milieu a été remplacé par du DMEM avec 10 % de FBS contenant 20 mM d'HEPES et 10 mM de butyrate de sodium et incubé pendant 8h. Le milieu a ensuite été remplacé par du DMEM avec 10 % de FBS contenant 20 mM d'HEPES et pas de butyrate de sodium et incubé pendant une nuit. Le lendemain, le milieu a été collecté et filtré sur un filtre de 0,45 μm. S'il n'était pas utilisé immédiatement, le virus était congelé à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Des rétrovirus codant pour des récepteurs antigéniques chimériques ont été produits comme décrit précédemment52. En bref, des cellules d'emballage Plat-E (Cell Biolabs) ont été transfectées avec des vecteurs pMSGV en utilisant Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Le milieu de culture a été remplacé 24 h plus tard et après 24 h supplémentaires, le milieu a été collecté, clarifié par centrifugation et passé à travers un filtre de 0, 45 μm avant stockage à -80 ° C.

Des vecteurs adénoviraux à délétion E1/E3 déficients en réplication Ad5-CMV-oIL-2 (Ad-oIL-2) et Ad5-CMV-Null (Ad-Null) ont été construits à l'aide du système de vecteur adénoviral AdEasy XL (Agilent). L'ADNc du clone 3A10 d'IL-2 orthogonal de souris a été synthétisé (GenScript) avec les sites de restriction 5 'KpnI et 3' HindIII et sous-cloné dans le site de clonage multiple de pShuttle-CMV (Addgene). Des cellules d'Escherichia coli BJ5183-AD-1 contenant pAdEasy-1 ont été transformées avec pShuttle-CMV-oIL-2 linéarisé Pmel pour une recombinaison homologue. La séquence du plasmide Ad recombinant résultant a été vérifiée et étendue dans des cellules XL10-Gold Ultracompetent avant la linéarisation PacI et la transfection dans des cellules HEK293T. Les adénovirus à titre élevé ont été purifiés par centrifugation en gradient de chlorure de césium (CsCl2) après plusieurs cycles d'amplification. Le CsCl2 a été remplacé par du tampon A19553 avec des unités de filtre centrifuge Amicon Ultra-15 (Millipore). Le titre viral (VP par ml) a été déterminé par spectrophotométrie (Nanodrop, Thermo Fisher Scientific).

Des vecteurs lentiviraux pour la transduction des lymphocytes T humains ont été produits dans des cellules HEK293T. Des plasmides lentiviraux pour la CAR anti-mésothéline M5 humaine (décrit précédemment50) et des récepteurs orthogonaux humains (ho2R ou ho9R liés à la GFP par une séquence 2A) ainsi que des plasmides d'encapsidation ont été transfectés dans des cellules HEK293T à l'aide de Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific). Une ultracentrifugation a été réalisée pour concentrer les surnageants lentiviraux collectés 24 h ou 48 h après la transfection, et les virus concentrés ont été stockés à -80 ° C.

La transduction virale de cellules T de souris dérivées de C57BL/6 a déjà été décrite9. En bref, des plaques de culture tissulaire à 12 puits ont été recouvertes pendant une nuit avec 2, 5 μg ml-1 de solution de CD3ε anti-souris (clone 145-2C11, Biolegend) dans du PBS stérile. Des suspensions unicellulaires ont été préparées à partir de la rate et des ganglions lymphatiques de souris C57BL / 6J âgées de 6 à 8 semaines par dissociation à travers un tamis cellulaire de 70 μm, suivie d'une lyse des globules rouges dans un tampon de lyse ACK (Gibco). Les cellules ont été remises en suspension dans un milieu de cellules T de souris contenant 100 UI ml-1 d'IL-2 de souris recombinante (mIL-2) et activées avec des CD3ε anti-souris liés à la plaque et des CD28 anti-souris solubles (5 μg ml-1, clone 37.51, BioXCell) pendant 24h. Les cellules T de souris activées ont été transduites par spinfection en utilisant des surnageants rétroviraux contenant du polybrène (10 μg ml-1) et 100 UI ml-1 mIL-2 à 2 600 tr/min pendant 90 min à 32 °C. Le surnageant viral a été remplacé par un milieu frais de cellules T de souris contenant 100 UI ml-1 mIL-2 et cultivé pendant 24 h. Les cellules ont été collectées par pipetage doux et remises en suspension à 1 × 106 par ml dans un milieu de cellules T frais contenant 100 UI ml-1 mIL-2 et développées pendant la nuit à 37 ° C avant d'autres analyses cellulaires en aval.

Pour la transduction rétrovirale des lymphocytes T pmel, des splénocytes de souris pmel âgées de cinq à dix semaines ont été prélevés un à trois jours avant la transduction et activés avec 50 U ml-1 mIL-2 (Peprotech) et 1 μg ml-1 souris peptide gp100 (Anaspec). Un jour avant la transduction, des plaques de culture tissulaire à six puits ont été recouvertes de rétronectine (Takara) et placées dans un réfrigérateur à 4 ° C pendant la nuit. Le lendemain, les plaques ont été bloquées avec du FBS à 0,5 % dans du PBS pendant 30 min et lavées avec du PBS. Le surnageant viral (2 ml) a été ajouté à chaque puits et centrifugé à 2 000 g pendant deux heures. Des cellules T pmel activées (3 × 106) ont été ajoutées à chaque puits avec 50 U ml-1 d'IL-2 de souris et centrifugées à 2 000 g pendant 10 min, puis cultivées à 37 ° C pendant 18 à 24 h. Ensuite, les cellules transduites viables ont été triées en fonction de l'expression de YFP et de l'exclusion de 7-AAD à l'aide d'un trieur de cellules Aria II (BD Biosciences), et reposées pendant la nuit avant utilisation dans des essais in vitro ou in vivo en aval. La transduction rétrovirale de cellules CAR T de souris a déjà été décrite52. En bref, des splénocytes de souris CD45.1 donneurs primaires (provenant de souris femelles CD45.1 B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ âgées de 4 à 6 semaines) ont été enrichis en cellules CD3+ par séparation par billes magnétiques (STEMCELL Technologies). Les cellules T ont été activées avec des Dynabeads CD3 / CD28 de souris (Thermo Fisher Scientific) en présence de 50 U ml-1 d'IL-2 humaine recombinante (Peprotech) pendant 48 h avant la spinfection sur des plaques recouvertes de rétronectine (Takara Bio). Les cellules ont été collectées pour des tests in vitro ou une injection intraveineuse deux jours après la spinfection.

Les cellules mononucléaires primaires du sang périphérique humain (PBMC) isolées d'un donneur humain sain par leucaphérèse ont été décongelées et laissées au repos pendant une nuit avant activation pendant deux jours avec des Dynabeads magnétiques anti-CD3/28 humains (Thermo Fisher Scientific) et de l'IL-2 humaine (500 U ml −1). Les cellules T ont été co-transduites pendant 48 h sur des plaques 6 puits recouvertes de Retronectin (Takara) et chargées avec 1 ml par puits de chaque rétrovirus (codant ho2R et NYESO1-TCR clone 1G4 ou ho9R et NYESO1-TCR clone 1G4) par spinfection . Les cellules activées et transduites ont été collectées et les billes ont été retirées en les plaçant sur un aimant de séparation de cellules EasySep pendant deux minutes. Les cellules ont été colorées avec un anticorps anti-humain Vβ13.1 PE (Beckman Coulter, reconnaît la chaîne β du clone NYESO1-TCR 1G4) et un colorant vivant / mort 7-AAD avant le tri cellulaire basé sur l'expression de YFP, Vβ13. 1, et exclusion du 7-AAD à l'aide d'un trieur de cellules Aria II (BD Biosciences).

Pour la transduction de lymphocytes T humains avec de l'anti-mésothéline M5 CAR et des ortho-récepteurs humains, des lymphocytes T CD4+ et CD8+ fraîchement isolés ont été mélangés dans un rapport de 1:1 et activés avec des Dynabeads magnétiques CD3/CD28 à un rapport de 3:1 entre les billes. rapport cellulaire. Les cellules T ont été co-transduites 24 h plus tard avec des vecteurs lentiviraux codant M5 CAR et ho2R-GFP ou ho9R-GFP. Au jour 5, les billes ont été retirées de la culture. Les cellules T ont été maintenues à 0, 8 × 106 par ml jusqu'à atteindre l'état de repos tel que déterminé par la taille des cellules à l'aide du compteur Multisizer 4 Coulter (Beckman), puis cryoconservées. Pour le tri en flux des cellules T double positives M5 CAR – ho2R-GFP et M5 CAR – ho9R-GFP, les cellules T co-transduites ont été décongelées et laissées au repos pendant la nuit avant la coloration avec l'IgG anti-humaine F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch ) pour M5 CAR et LIVE/DEAD Aqua pour l'exclusion des cellules mortes. GFP a servi de marqueur de substitution pour ho2R et ho9R. Le tri a été effectué sur un BD FACSAria Fusion (BD Biosciences).

Des cellules T primaires de souris ou humaines en croissance active ont été laissées au repos dans du RPMI-C dépourvu d'IL-2 pendant 24 h avant les tests de signalisation. Les cellules ont été étalées dans une plaque à fond rond à 96 puits à liaison ultra-faible dans 50 ul de milieu RPMI-C chaud. Les cellules ont été stimulées par addition de cytokines recombinantes pendant 20 min à 37 ° C, et la réaction a été terminée par fixation avec 1,5 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 15 min à température ambiante avec agitation. Les cellules ont été lavées et perméabilisées avec du méthanol à 100% glacé pendant 60 min sur de la glace ou stockées à -80 ° C pendant la nuit. Les cellules ont été lavées avec du tampon FACS avant coloration avec des anticorps pSTAT (tableau supplémentaire 5) pendant 1 h à 4 ° C dans l'obscurité. Les cellules ont été lavées et analysées sur un CytoFlex (Beckman Coulter). Les données représentent l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) et les points ont été ajustés à un modèle log(agoniste) par rapport à la dose-réponse à l'aide de Prism 8.4 (GraphPad). Pour la stratégie de déclenchement, voir la Fig. 2 supplémentaire.

Les cellules CAR T privées d'IL-2 et de FBS ont été stimulées pendant 20 min avec des cytokines et lysées avec un tampon RIPA glacé additionné d'un cocktail inhibiteur de protéase / phosphatase (Halt, Thermo Fisher Scientific) pour extraire la protéine. Trente microgrammes de protéines totales ont été chargés dans des gels SDS – PAGE (NuPage Bis-Tris, Thermo Fisher Scientific) puis transférés sur des membranes PVDF (Immobilon-FL, Millipore). La détection de pSTAT1, pSTAT3, pSTAT5 et GAPDH a été réalisée avec des anticorps primaires respectifs suivis d'anticorps secondaires marqués par IRDye ou d'anticorps secondaires liés à HRP. Les membranes ont été imagées sur un Odyssey CLx (LI-COR Biosciences).

Les cellules T primaires de souris en croissance active ont été laissées au repos dans du RPMI-C dépourvu d'IL-2 pendant 48 h avant le marquage avec CellTracer Violet (CTV, Thermo Fisher Scientific). Les cellules marquées ont été ensemencées à 50 000 cellules T par puits dans 50 μl dans une plaque à fond rond à 96 puits. Les cellules ont été cultivées pendant deux jours dans des dilutions en série de MSA-oIL-2. La cytokine a été reconstituée au jour 2. Au jour 4, la prolifération cellulaire marquée au CTV a été évaluée par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) à l'aide du CytoFlex. Les portes de cellules vivantes étaient basées sur FSC et SSC. La prolifération des cellules CAR T a été évaluée en ensemençant 50 000 cellules par puits dans une plaque à 96 puits à fond rond en présence de MSA-oIL-2 ou MSA-IL-2. Au jour 2, les cellules ont été nourries avec du milieu frais et des cytokines. Les numérations cellulaires quotidiennes ont été acquises en colorant une aliquote de cellules avec le colorant de viabilité Calcein AM (Thermo Fisher Scientific) et analysées sur le cytomètre Celigo Image (Nexcelom Bioscience).

Pour les tests Luminex, les cellules CAR T transduites ont été incubées dans des plaques à 96 puits à fond rond (50 000 cellules par puits) en triple pendant quatre jours en présence de cytokines, après quoi les surnageants ont été analysés avec un Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 /Treg Cytokine 17-Plex Mouse ProcartaPlex Panel (Thermo Fisher Scientific). Un réseau de billes de cytokines (BD Biosciences) a été utilisé pour mesurer individuellement l'IFNγ à partir du surnageant de la coculture B16-F10 avec des cellules T pmel conformément aux instructions du fabricant. L'expression d'oIL-2 à partir de cellules PDA7940b (10 000 cellules par puits, plaque de 96 puits) a été évaluée par ELISA IL-2 de souris (Abcam) dans des surnageants de culture cellulaire à différents moments après l'infection avec Ad-Null ou Ad-oIL-2 ( 100 PV par cellule). L'expression in vivo a été évaluée en injectant du PBS, Ad-Null ou Ad-oIL-2 (1 × 109 VP par tumeur) dans des tumeurs PDA7940b et en collectant 72 h plus tard. Les tumeurs ont été dissociées par trois cycles de congélation-décongélation et les homogénats ont été analysés pour l'IL-2 de souris par ELISA. Le sang terminal a été recueilli par ponction cardiaque et transformé en sérum par centrifugation. Les concentrations d'IL-2 ont été normalisées à la teneur en protéines totales.

Des cellules tumorales PDA7940b ont été ensemencées à raison de 10 000 cellules par puits dans une xCELLigence E-Plate à 96 puits (Agilent). Vingt-quatre heures plus tard, des cellules CAR T transduites pré-incubées pendant 48 h en présence d'oIL-2 ont été ajoutées dans un rapport de 2: 1 et l'indice de cellule cible a été enregistré toutes les 15 min dans le Real-Time Cell Analysis (RTCA ) Analyseur (Agilent). La destruction des lymphocytes T des lignées cellulaires B16-F10 transduites avec un RFP de localisation nucléaire a déjà été décrite54. En bref, des cellules B16-F10-RFP + pulsées avec 100 ng ml-1 IFNγ pendant 18 h ont été étalées dans une plaque à 96 puits à fond plat en triple à 5 000 cellules par puits pour IncuCyte Live Cell Analysis (Essen Bioscience). Des cellules Pmel T (o2R ou o9R, prétraitées avec MSA-IL-2 ou MSA-oIL-2 pendant 48 h) ont été ajoutées à un rapport E:T de 2: 1 et deux images en contraste de phase et fluorescentes ont été obtenues de chaque puits toutes les deux heures à l'aide du système d'imagerie en direct IncuCyte et quantifié par le pourcentage de confluence. Le test de destruction répétitive des lymphocytes T TCR humains a également été effectué à l'aide de l'analyse des cellules vivantes IncuCyte. Des cellules de mélanome humain (nRFP-M407, 5 × 105) ont été étalées par puits dans des plaques à 6 puits. Des cellules T humaines non transduites ou co-transduites (co-transduites avec ho2R-NYESO1-TCR ou ho9R-NYESO1-TCR, et pré-incubées pendant 48 h avec MSA-hoIL-2) ont été ajoutées en double à un 1: 1 E :T ratio. Toutes les 72 h, des cellules de mélanome (nRFP-M407, 5 × 105) ont été ajoutées à chaque puits ; la cytokine orthogonale (MSA-hoIL-2) a été reconstituée 24 h avant chaque rechallenge tumoral.

Le test de destruction répétitive des cellules CAR T humaines a été effectué à l'aide de l'analyseur xCELLigence. Des cellules tumorales pancréatiques humaines AsPC-1 ont été ensemencées sur une plaque E xCELLigence à 96 puits à raison de 10 000 cellules par puits. Vingt-quatre heures plus tard, des cellules M5 CAR – ho2R ou M5 CAR – ho9R pré-incubées pendant 48 h avec MSA-hoIL-2 (1 µM) ont été ajoutées en triple à un rapport E: T de 1: 1. Toutes les 48h, les cellules CAR T ont été collectées, lavées, remises en suspension dans du MSA-hoIL-2 frais et ajoutées sur de nouveaux puits de la E-Plate ensemencés de cellules tumorales (10 000 par puits) la veille. Après le dernier cycle de restimulation, les lymphocytes T ont été collectés pour le phénotypage par cytométrie en flux.

Pour les expériences de croissance tumorale B16-F10 in vivo, des lignées cellulaires à passage précoce ont été utilisées (moins de 10 passages). Des cellules B16-F10 (5 × 105) ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc droit de souris femelles C57BL/6 âgées de 6 à 10 semaines. Le cas échéant, les souris ont été lymphodéplétées avec 500 cGy d'irradiation corporelle totale un jour avant l'ACT. Les cellules T (dérivées de souris femelles) ont été transférées de manière adoptive environ sept jours après l'inoculation de la tumeur, ou lorsque les tumeurs sont devenues palpables. Plus précisément, 5 × 106 cellules T triées ont été remises en suspension dans 50 μl de PBS par souris et administrées par injection rétro-orbitale. Lorsque cela est indiqué, les souris ont reçu un traitement avec des cytokines : IL-2 de souris liée à l'albumine sérique de souris (MSA) (MSA-IL-2) ou IL-2 orthogonale MSA (MSA-oIL-2) (2,5 × 104 unités par jour, intrapéritonéale ) pendant cinq jours consécutifs (ou plus, le cas échéant) à compter du jour de l'ACT. La taille de la tumeur (longueur × largeur) a été surveillée avec des compas trois fois par semaine et le volume a été calculé comme (longueur × largeur2)/2). Du sang périphérique (10 μl) a été prélevé à des moments précis de la veine caudale pour la quantification des lymphocytes T pmel transférés de manière adoptive par cytométrie en flux. Les souris ont été euthanasiées lorsque le volume total de la tumeur dépassait 2 000 mm3, conformément aux directives de l'IACUC.

Le modèle de tumeur PDA syngénique a déjà été décrit52. En bref, des tumeurs PDA7940b établies par voie sous-cutanée chez des souris C57BL/6 femelles ont été traitées par voie intratumorale avec le virus témoin Ad-Null (1 × 109 VP par injection) ou Ad-oIL-2 (1 × 109 VP par injection) dans 50 μl de PBS les jours 0 et 4. Les cellules CAR T (5 × 106 cellules CAR-positives vivantes) ont été administrées par injection dans la veine caudale le jour 1 dans 200 μl de PBS. Une chimiothérapie de conditionnement à base de cyclophosphamide a été réalisée au jour -1 par injection intrapéritonéale (120 mg kg -1). Les dimensions de la tumeur ont été mesurées avec des compas numériques et les volumes ont été calculés comme suit : volume = (longueur x largeur2)/2. Les souris guéries ont été rechallengées avec des cellules PDA7940b par injection sous-cutanée dans le flanc opposé et la taille de la tumeur a été enregistrée 24 jours plus tard par mesure au pied à coulisse. Des souris naïves appariées selon l'âge ont été injectées de manière identique et ont servi de témoin pour la croissance tumorale.

Pour l'immunophénotypage in vitro des lymphocytes T transduits orthogonal-cytokne-récepteur, les lymphocytes T triés ont été plaqués avec des doses équipotentes de MSA-oIL-2 ou MSA-IL-2 en triple. Après 48 h, les cellules T ont été collectées et colorées en surface. Pour les évaluations in vivo, le sang périphérique a été obtenu par échantillonnage de la veine caudale aux moments indiqués. Au moment de l'autopsie, les rates ont été écrasées et lavées avec du PBS sur un tamis cellulaire de 70 μm pour recueillir les splénocytes. Les splénocytes et les échantillons de sang périphérique ont été traités avec un tampon de lyse ACK avant la coloration des anticorps.

Les tumeurs B16 ont été hachées et dissociées à l'aide d'un kit de dissociation de tumeurs de souris (Miltenyi Biotec) et d'un dissociateur GentleMACS Octo (Miltenyi Biotec). Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans du PBS et filtrées à travers un tamis cellulaire de 70 μm pour obtenir des suspensions unicellulaires. Les cellules ont été colorées avec des anticorps à 4 ° C pendant 30 min dans un tampon FACS. Les anticorps sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 5. Le colorant de viabilité 7-AAD a été utilisé pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux à l'aide d'un LSRFortessa (BD Biosciences) et les données ont été recueillies à l'aide de BD FACSDiva (v.6.1.2). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo (v.10, BD Biosciences). Les tumeurs PDA7940b ont été excisées, pesées, hachées au scalpel et dissociées à l'aide d'un cocktail enzymatique composé de hyaluronidase (2,5 U ml-1), DNAse (50 U ml-1), collagène de type I/II/IV (75 U ml-1, 35 U ml-1, 75 U ml-1, respectivement) dans du RPMI 1640 additionné de 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules CD45-positives ont été isolées à partir de suspensions tumorales unicellulaires avec des microbilles CD45 (TIL) conformément aux instructions du fabricant (Miltenyi Biotec) et stockées dans de l'azote liquide. La quantification des cellules CAR T infiltrant la tumeur a été réalisée à l'aide de billes CountBright (Thermo Fisher Scientific) et normalisée en fonction du poids de la tumeur. Pour la stratégie de déclenchement, voir la Fig. 3 supplémentaire.

Pour la cytométrie de masse, les cellules ont d'abord été fixées avec du PFA à 1,6 % pendant cinq minutes à température ambiante. Les cellules ont été lavées avec 10 ml de tampon de coloration cellulaire MaxPar (Fluidigm) et centrifugées à 970 g à 4 ° C pendant 10 min. Ensuite, les cellules ont été remises en suspension dans le cocktail d'anticorps de surface pendant 30 min à température ambiante. Les cellules ont été lavées avec 5 ml de PBS et remises en suspension dans 1 ml de méthanol glacé pendant 15 min sur de la glace. Les cellules ont été à nouveau lavées avec le tampon de coloration cellulaire MaxPar et colorées avec le cocktail d'anticorps intracellulaires pendant 30 min à température ambiante. Enfin, les cellules ont été lavées avec 10 ml de tampon de coloration cellulaire MaxPar et colorées avec la solution d'intercalation (Cell-ID Intercalator-Ir, 201192B) à une dilution de 1:6 000 dans Maxpar Fix et Perm Buffer avec 1,6 % de PFA (Fluidigm, 201067) pendant la nuit. à 4 °C. Les données ont été acquises à l'aide du cytomètre de masse Fluidigm Helios. L'analyse a été effectuée à l'aide d'Omiq sur la base de données à l'échelle de l'arcsinh contrôlées sur des leucocytes CD45 + singulets vivants ou des lymphocytes T CD8 + (pour la stratégie de déclenchement, voir la Fig. 4 supplémentaire). Les cellules ont été intégrées dans une visualisation bidimensionnelle à l'aide d'opt-SNE et regroupées à l'aide de FlowSOM avec un métaclustering de coude à l'aide de distances euclidiennes. Les grappes différentiellement abondantes ont été déterminées à l'aide de edgeR avec un seuil de signification de la valeur P de 0, 05 et un changement de pli transformé en log ≥ 1. Les graphiques ont été générés à l'aide du package R ggplot.

Des cellules T co-transduites humaines (soit ho2R – NYESO1-TCR, soit ho9R – NYESO1-TCR) ont été collectées à partir d'une coculture de provocation tumorale répétitive 72 h après la provocation tumorale la plus récente et 24 h après que la cytokine orthogonale ait été reconstituée dans le milieu de culture. Les cellules T (1 × 105) ont été cultivées dans une plaque à 96 puits avec des Dynabeads CD3/CD28 anti-humains (Thermo Fisher Scientific) ou des cellules de mélanome à un rapport E:T de 1:1 (nRFP-M407 ou M263) en présence de brefeldin A et de monensin. Après quatre heures, les cellules ont été colorées en surface pendant 30 min à température ambiante, fixées et perméabilisées pour la coloration des cytokines intracellulaires pendant 30 min à température ambiante. Pour la coloration des cytokines intracellulaires de leucocytes enrichis infiltrant les tumeurs CD45+ à partir de tumeurs PDA740b, les cellules ont été stimulées pendant six heures avec Cell Activation Cocktail (avec Brefeldin A) (Biolegend), fixées/perméabilisées dans le Cyto-Fast Fix/Perm Buffer Set (Biolegend) et colorées avec un anticorps anti-IFNγ. Les cellules ont été lavées et analysées par cytométrie en flux en utilisant un LSRII (BD Biosciences). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo (v.10, BD Biosciences).

Des échantillons de tumeurs fixés au formol et inclus en paraffine ont été coupés en sections de 4 μm d'épaisseur sur des lames de verre pour la coloration. La méthode Opal basée sur l'amplification du signal tyramide (TSA) a été utilisée dans cette étude pour la coloration par immunofluorescence (Opal Polaris 7‐Color Automation IHC Kit ; Akoya Biosciences ; NEL871001KT). Les fluorophores Opal ont été utilisés à une dilution de 1 pour 150, conformément aux recommandations du fabricant. Un single-plex fluorescent a été réalisé pour chaque biomarqueur et comparé au single-plex chromogénique approprié pour évaluer les performances de coloration. Une fois que chaque cible a été optimisée avec une coloration en simple plex, le test multiplexé Opal 6 a été utilisé pour effectuer une coloration multiplex des lames. Nous avons appliqué des anticorps primaires à des échantillons de rate de souris en tant que témoins à des concentrations optimisées préalablement déterminées pour la coloration en simple plex des tissus témoins. La coloration a été réalisée à l'aide du système BOND RX (Leica Biosystems). La séquence d'anticorps pour la coloration multiplex était : FOXP3 (Opal 480), CD4 (Opal 520), PD-1 (Opal570), CD8 (Opal 620) et CD3 (Opal 690). La coloration a été réalisée après 20 min de récupération d'antigène induite par la chaleur à l'aide de Bond Epitope Retrieval Solution 2 (Leica Biosystems). Les anticorps sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 5 et ont été utilisés à une dilution de 1:200 avec une incubation d'une heure. Toutes les lames marquées par fluorescence ont été contre-colorées avec du DAPI et numérisées sur le Vectra Polaris (Akoya Biosciences) à un grossissement × 20 en utilisant des temps d'exposition appropriés. Les données de la caméra multispectrale ont été analysées par le logiciel d'imagerie InForm (Akoya Biosciences) et la quantification a été réalisée à l'aide du logiciel d'analyse d'images HALO (Indica Labs).

Les souris ont été euthanasiées par asphyxie au CO2. Immédiatement après la mort, le sang (n = 3 souris par groupe) a été prélevé par ponction cardiaque dans des tubes Microvette (Sarstedt) et laissé coaguler à température ambiante pendant 30 min avant centrifugation à 12 000 g pendant 10 min. Le sérum a été conservé à -80 °C avant analyse. Les niveaux de cytokines dans les sérums ont été mesurés avec le panel de cytokines 25-plex de souris (IDEXX Bioanalytics). Les taux sériques de Ca, P, K et d'acide urique ont été mesurés avec un panel de chimie clinique personnalisé (IDEXX Bioanalytics).

Une nécropsie complète avec examen macroscopique post-mortem a été réalisée sur toutes les souris. Les échantillons de tissus fixés au formol ont été découpés conformément aux directives RITA (https://reni.item.fraunhofer.de/reni/trimming/), puis traités de manière routinière pour l'inclusion de paraffine, la section et la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Les lames résultantes ont été analysées par un pathologiste vétérinaire certifié par le conseil, aveuglé par la conception expérimentale.

La distribution de l'expression de la mésothéline et l'infiltration des cellules CAR T dans les méninges ont été étudiées au moyen d'ARN fluorescent multiplex ISH (RNAscope Multiplex Fluorescent Assay, ACD Bio) comprenant une sonde personnalisée conçue contre le rétrovirus de souris utilisé pour transduire les cellules T avec CAR et ortho- récepteurs. Le test a été réalisé sur des coupes de cerveau fixées au formol et incluses en paraffine. L'imagerie de la lame entière sur les sections marquées par fluorescence résultantes a été réalisée à l'aide du scanner de diapositives Aperio VERSA 200 (Leica Biosystems). Les cellules CAR T et les cellules positives à la mésothéline ont finalement été comptées à l'aide de l'outil de comptage d'objets inclus dans le logiciel Aperio ImageScope (Leica Biosystems).

Pour les expériences in vitro décrites dans la figure 2 et le matériel supplémentaire connexe, les cellules T o2R et o9R pmel ont été stimulées avec 5 μM d'oIL-2 ou 0, 05 μM d'oIL-2 pendant 48 h. L'ARN a été extrait à l'aide du mini kit RNeasy (Qiagen). Les bibliothèques d'ARN-seq ont été préparées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque de brins d'ARNm KAPA, conformément aux recommandations du fabricant. Les bibliothèques ont été regroupées et séquencées sur la plate-forme Illumina HiSeq3000 (lectures à extrémité unique de 50 pb). Les lectures ont été alignées sur le génome de référence de la souris (mm9/GRCm38) à l'aide de HISAT2 (v.2.0.4) (réf. 55). L'expression génique a été quantifiée à l'aide de HTSeq-counts (v.0.6.1) (réf. 56). L'analyse de l'expression différentielle a été effectuée à l'aide de DESeq2 (réf. 57), et l'analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes a ensuite été effectuée à l'aide des packages R fgsea (réf. 58) et msigdbr (réf. 59), en particulier sur l'ensemble de gènes annoté TFactS60, et visualisé à l'aide le paquet ggplot2 R. Les gènes exprimés de manière différentielle ont été filtrés pour ceux avec une valeur P ajustée inférieure à 0,01 et un changement de pli transformé log2 ≥ 1. L'expression génique a été visualisée à l'aide de l'expression génique normalisée (calculée à l'aide de la transformation rlog de DESeq2 et mise à l'échelle par ligne) à l'aide de la package pheatmap R. L'analyse en composantes principales et les cartes thermiques échantillon à échantillon ont été générées à l'aide des fonctions R prcomp et dist, respectivement.

Pour les expériences in vitro décrites à la Fig. 3, les cellules CAR-o2R et CAR-o9R ont été stimulées pendant 48 h avec MSA-oIL-2 ou MSA-IL-2 et l'ARN total a été extrait à l'aide du mini kit RNeasy (Qiagen). L'expression de l'ARN a été analysée à l'aide du nCounter Mouse Immunology Panel (Nanostring Technologies). L'analyse a été effectuée comme décrit ci-dessus.

Tous les tests t non appariés sont bilatéraux. Les valeurs P exactes sont fournies dans le tableau supplémentaire 6. Pour les diagrammes en boîte et moustaches (Fig. 2j), les diagrammes en boîte représentent la médiane et les premier et troisième quartiles, et les moustaches s'étendent aux minima et maxima. Sauf indication contraire, n fait référence à des répliques biologiques et non techniques. Pour les expériences de croissance et de survie des tumeurs de souris, la taille de l'échantillon a été sélectionnée sur la base de travaux antérieurs utilisant les modèles ACT respectifs (B16-pmel et PDA7940b-mésothéline CAR). Les souris avec des tumeurs de taille égale ont été randomisées avant le traitement ; tumeurs ont été mesurées en aveugle. Les données des Fig. 1b – f sont représentatives de trois expériences indépendantes. Les données de la Fig. 2b, e, g sont représentatives de deux expériences indépendantes. Sur la figure 2b, n = 6 souris par groupe sauf n = 5 pour pmel + MSA-IL-2 et n = 4 pour pmel + MSA-IL-2, lymphodéplétées. Sur la figure 2c, n = 6 souris par groupe, sauf n = 5 pour les cellules T BL6 + MSA-IL-2 et pmel + MSA-IL-2. Dans la Fig. 2d, n = 6 souris par groupe, sauf n = 5 pour pmel + MSA-IL-2 et pmel + MSA-IL-2 (lymphodepleted), et n = 3 pour les lymphocytes T BL6 + MSA-IL-2 . Les données des Fig. 2c, d sont représentatives de trois expériences indépendantes. Les données de la Fig. 2f sont représentatives de deux expériences indépendantes et les conclusions sont confirmées par trois expériences indépendantes utilisant la cytométrie en flux (Fig. 2f), la cytométrie de masse (Fig. 2h) et l'immunofluorescence (Extended Data Fig. 5g). Les données des Fig. 3a, c – e sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les données de la figure 3b sont représentatives de trois expériences indépendantes. Les expériences d'efficacité (Fig. 3i, j) sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les données des Fig. 4a, e – h sont représentatives de deux expériences indépendantes. Les données des Fig. 4b – d sont représentatives de trois expériences indépendantes.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données associées à cette étude sont présentes dans le manuscrit ou ses fichiers d'informations supplémentaires. Les données d'expression génique sont disponibles sur https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ sous les numéros d'accession GSE199909 et GSE199956.

Une correction à cet article a été publiée : https://doi.org/10.1038/s41586-022-05548-6

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Nous reconnaissons le Janis V. Giorgi Flow Cytometry Core Laboratory, le Broad Stem Cell Center Flow Cytometry Core, le Tissue Pathology Core Laboratory (TPCL), le Technology Center for Genomics and Bioinformatics et la Division of Laboratory Animal Medicine (DLAM) à UCLA. Nous reconnaissons le Penn Cytomics and Cell Sorting Resource Laboratory, le Human Immunology Core, le Penn Vet Comparative Pathology Core (CPC), le Penn University Laboratory Animal Resources et le Wistar Institute Genomics Core Facility. Nous reconnaissons le National Heart, Lung, and Blood Institute DNA Sequencing and Genomics Core. Nous remercions N. Wellhausen, A. Rennels, A. Aznar Gomez et AD Posey Jr pour leur assistance technique experte. Le financement a été fourni par le Howard Hughes Medical Institute (KCG); la Fondation Ludwig (KCG); la Fondation Mathers (KCG); le Parker Institute for Cancer Immunotherapy (KCG, AR, CHJ, AK et MS) ; les National Institutes of Health (NIH), National Cancer Institute K08 5K08CA245181 (AK), R35 CA197633 (AR), P30 CA016042 (AR), U54CA244711 (CHJ et KCG), T32 5T32CA009140 (PCR) et P30 CA016520 (ER); le NIH, Institut national des allergies et des maladies infectieuses R37AI051321 (KCG) ; le Fonds de la famille Ressler (AR) ; le Fonds Ken et Donna Schultz (AR); la Fondation de recherche sur le cancer Damon Runyon (106-20, AK); la Fondation du centre de cancérologie UCLA Jonsson (AK); la Fondation Joseph Drown (AK); les instituts nationaux de la santé S10 OD023465-01A1 (ER); et les National Institutes of Health, Division of Intramural Research, National Heart, Lung, and Blood Institute (WJL)

Les auteurs suivants ont contribué à parts égales : Anusha Kalbasi, Mikko Siurala, Leon L. Su

Département de radio-oncologie, David Geffen School of Medicine et Jonsson Comprehensive Cancer Center, Université de Californie, Los Angeles, Los Angeles, Californie, États-Unis

Anusha Kalbasi, Mito Tariveranmoshabad et Sarah V. Kremer

Parker Institute for Cancer Immunotherapy, San Francisco, Californie, États-Unis

Anusha Kalbasi, Mike Siura, Anthony Ribas, Carl H. June et K. Christopher Garcia

Centre d'immunothérapies cellulaires, Perelman School of Medicine, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis

Mikko Siurala, Pranali Ravikumar, Tong Da, Sophia Castelli, Sangya Agarwal, John Scholler, Decheng Song, Philipp C. Rommel, Regina M. Young et Carl H. June

Départements de physiologie moléculaire et cellulaire et de biologie structurale, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Leon L. Su, Lora K. Picton et K. Christopher Garcia

Laboratoire d'immunologie moléculaire et Centre d'immunologie, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis

Peng Li, Jian-Xin Lin et Warren J. Leonard

Division d'hématologie/oncologie, Département de médecine, David Geffen School of Medicine et Jonsson Comprehensive Cancer Center, Université de Californie, Los Angeles, Los Angeles, Californie, États-Unis

Helena Escuin-Orders, Amy L. Sun et Anthony Ribas

Penn Vet Comparative Pathology Core, Département de pathobiologie, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA, États-Unis

Enrico Radelli

Stanford Cancer Institute, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

K. Christophe Garcia

Howard Hughes Medical Institute, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

K. Christophe Garcia

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Conceptualisation : AK, MS, LLS, AR, CHJ et KCG Méthodologie : AK, MS, LLS, MT, LKP, PL, J.-XL, JS et PCR Investigation : AK, MS, LLS, MT, LKP, ALS, PL , J.-XL, PR, TD, SVK, HE-O., DS, SCSA et ER Visualisation : AK, MS et LLS Financement acquisition : AK, AR, CHJ et KCG Supervision : AK, RMY, AR, CHJ et KCG Rédaction (ébauche originale) : AK, MS et LLS Rédaction (révision et édition) : AK, MS, LLS, RMY, WJL, AR, CHJ et KCG

Correspondance à Anusha Kalbasi, Anthony Ribas, Carl H. June ou K. Christopher Garcia.

AK siège au conseil consultatif de T-Cure Therapeutics et de Certis Oncology, détient des actions de Certis Oncology et reçoit des fonds de recherche de Highlight Therapeutics. KCG, LLS et LKP sont les inventeurs de la demande de brevet PCT/US2020/050232 sur la technologie ortho-9 et sont actionnaires de Synthekine Therapeutics. KCG est le fondateur de Synthekine Therapeutics. AR a reçu des honoraires pour ses conseils auprès d'Amgen, Bristol-Myers Squibb, Chugai, Genentech, Merck, Novartis, Roche et Sanofi, est ou a été membre du conseil consultatif scientifique et détient des actions dans Advaxis, Arcus Biosciences, Highlight Therapeutics, Compugen , CytomX, Five Prime, FLX Bio, ImaginAb, IsoPlexis, Gilead Kite, Lutris Pharma, Merus, PACT Pharma, Rgenix et Tango Therapeutics. CHJ a reçu des honoraires pour avoir consulté, est membre du conseil d'administration d'AC Immune, est membre du conseil consultatif scientifique et détient des actions dans Bluesphere Bio, Cabaletta Bio, Carisma Therapeutics, Cellares, Celldex, DeCART Therapeutics, Kiadis Pharma , Tmunity Therapeutics, WIRB-Copernicus Group et Ziopharm Oncology, et perçoit des redevances pour la propriété intellectuelle concédée sous licence à Novartis et Tmunity.

Nature remercie Thomas Malek, Michel Sadelain et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de cet ouvrage.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, pSTAT-1, -3, -5 et -6 courbes de réponse à la dose de signalisation du récepteur chimère orthoIL-2Rβ ICD exprimant les lymphocytes T stimulés avec MSA-oIL2 pendant 20'. b, pSTAT-1, -3 et -5 signalant la réponse à la dose de cellules T non transduites ou exprimant o2R ou o9R stimulées avec MSA-oIL2 ou MSA-IL2 pendant 20'. c, d, expression d'IL-9R sur des lymphocytes T transduits par simulation ou transduits par IL-9R à partir de souris transgéniques C57BL6 (c) ou pmel TCR (d). e, Courbes dose-réponse de la phosphorylation de STAT1, STAT3 et STAT5 dans les lymphocytes T pmel transduits avec IL-9R natif (pmel-IL-9R), o9R (pmel-o9R) ou faussement transduits (pmel) et stimulés avec IL-9 , MSA-IL2 ou MSA-oIL2. Les données sont présentées sous forme de fluorescence moyenne ± SEM, n = 3 réplicats biologiques, sauf indication contraire.

Données source

a–c, pSTAT5 (a), pSTAT3 (b) et pSTAT1 (c) signalant dans o9R exprimant des lymphocytes T C57BL/6 traités avec une titration de dose de 10 fois de MSA-IL2 (à partir de 100 nM) en l'absence (ouvert) ou présence de MSA-oIL2 [5 μM] (rempli) pendant 20'. Données présentées sous forme de fluorescence moyenne ± SEM, n = 3 répliques biologiques, YFP(+) fermées.

Données source

a, Courbes de prolifération in vitro de titrage de dose de o2R et du récepteur chimérique orthogonal (o4R, o7R, o9R, o21R) exprimant des lymphocytes T cultivés pendant quatre jours dans MSA-IL2 (symbole ouvert) ou MSA-orthoIL2 (symbole rempli). Les données représentent les cellules CD8 + YFP (+) vivantes totales normalisées à la croissance maximale de chaque récepteur chimérique différent exprimant des cellules cultivées dans MSA-IL2. Les données représentent la moyenne de n = 2 répétitions biologiques. b, Prolifération in vitro de lymphocytes T marqués au CTV transduits avec o2R (rouge) ou o9R (bleu) cultivés pendant quatre jours dans MSA-oIL2 (courbes pleines) ou MSA-IL2 (courbes vides). YFP(+) fermé ; l'une des trois parcelles représentatives illustrées.

Données source

a, Phosphorylation de STAT1, STAT3 et STAT5 dans les lymphocytes T pmel o2R versus o9R après stimulation de 30' avec MSA-oIL2 (5 μM). Montré sont MFI de doubles biologiques individuels, fermés sur des cellules YFP +. **, p < 0,01 ; ****, p < 0,0001 (ANOVA). b, Voici sept expériences répétées mesurant la prolifération in vitro (mesurée par la croissance du pli) de cellules T o2R ou o9R pmel sur 48 h en culture avec MSA-oIL2, (chaque point de données représente la moyenne ± SD, n = 3). *, p < 0,05 (test t apparié de rapport, bilatéral).

a, b, Survie des souris porteuses de tumeurs B16-F10 traitées avec (a) des cellules T o2R ou (b) o9R pmel et MSA-IL2 ou MSA-oIL2. Les lymphocytes T BL/6 traités avec MSA-IL2 ont été utilisés comme contrôle des lymphocytes T hors cible. Cellules T pmel non transduites plus mIL-2 chez des souris lymphodéplétées et non lymphodéplétées porteuses de tumeurs ont servi de témoins. c, effet des lymphocytes T o9R pmel chez un hôte lymphodéplété. Croissance tumorale (moyenne ± SEM, panneau de gauche) de tumeurs B16-F10 chez des souris C57BL/6 lymphodéplétées traitées avec des lymphocytes T o9R pmel et MSA-IL2, MSA-oIL2 ou pas d'IL2. d, Courbes de croissance tumorale B16-F10 individuelles liées aux courbes de survie illustrées à la Fig. 2e. Toutes les souris n'étaient pas lymphodéplétées sauf un groupe (en violet) qui a reçu une irradiation corporelle totale (5Gy). CR, régression complète. *, p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ****, p < 0,0001 (ANOVA). e, regroupement opt-SNE de leucocytes infiltrant la tumeur CD45 + sept jours après le transfert adoptif des cellules T pmel o2R (à gauche) et o9R (au milieu) (n = 4 souris / groupe; les souris ont été traitées sans lymphodéplétion et traitées MSA-oIL2 2,5x104 unités/jour pendant cinq jours en commençant par ACT). Parcelle volcanique de grappes différentiellement abondantes dans les tumeurs de souris traitées avec des cellules T o9R par rapport à o2R pmel (panneau de droite). f, regroupement opt-SNE du sous-ensemble de cellules T o9R et o2R pmel infiltrant la tumeur chez des hôtes non lymphodéplétés traités avec MSA-oIL2 (n = 4 souris/groupe, panneau de gauche), avec des parcelles séparées pour chaque groupe de traitement illustrant uniquement de manière différentielle grappes abondantes (panneau du milieu) et une parcelle de volcan de grappes différentiellement abondantes annotées avec des caractéristiques distinctives (panneau de droite). g, Infiltration tumorale de lymphocytes T CD3+CD8+ et de lymphocytes T CD8+PD1+ chez des hôtes non lymphodéplétés traités avec des lymphocytes T o2R et MSA-oIL2 ou o9R pmel et MSA-oIL2 par multiplex IHC (rouge = CD3, orange = CD8 , jaune = PD1, vert = CD4, turquoise = FOXP3). Les images sont représentatives des tumeurs de n = 3 souris/groupe et d'une expérience indépendante (conclusions vérifiées dans trois expériences indépendantes par cytométrie de flux et de masse). Quantifications (moyenne ± SD) indiquées à droite (n = 3 répétitions biologiques/groupe). h, Croissance in vitro (moyenne ± ET, n = 3 réplicats biologiques/groupe) de cellules tumorales nRFP+ B16-F10 co-cultivées avec des cellules T o2R ou o9R pmel (rapport E:T 2:1) prétraitées avec MSA-IL2 (50nM) . i, sécrétion d'IFNγ par des cellules T pmel oIL-2R et oIL-9R co-cultivées avec un mélanome B16-F10 in vitro pendant 24 h. Les cellules T ont été prétraitées avec MSA-oIL2 (5 µM) pendant 48 h in vitro avant la coculture (moyenne ± SD, n = 3 répétitions biologiques/groupe). *, p < 0,05 ; test t non apparié, bilatéral.

Données source

a, expression de surface de CD62L, Fas (CD95) et CD44 en pourcentage de cellules T o9R pmel triées CD8 + Thy1.1 +, cellules T o2R pmel ou cellules T pmel transduites avec IL-9R de type sauvage (pmel-IL- 9R) et traité avec MSA-IL2 (0,05 μM), MSA-oIL2 (5 μM) ou IL-9 (0,05 μM) pendant 48 h in vitro. Montré sont moyenne ± SD, n = 3 répétitions biologiques/groupe. ns, non significatif ; ****, p < 0,0001 ; tests t non appariés, bilatéraux. b, analyse transcriptomique non supervisée (RNA-seq) de cellules T triées pmel-o2R (n = 3) et pmel-o9R (n = 3) 48 h après exposition à MSA-oIL2 ou MSA-IL2 in vitro. Carte thermique des gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules T pmel o2R et o9R traitées avec MSA-oIL2 (5 μM) (panneau de gauche). Groupes traités par MSA-IL2 (50 nM) également représentés. Lors de l'analyse en composantes principales (PC1 contre PC2, panneau en haut à droite), les échantillons sont séparés par groupe de traitement. Les échantillons se regroupent par groupe de traitement lorsqu'ils sont disposés par distances échantillon-échantillon dans une carte thermique (panneau inférieur droit), avec les cellules T o9R pmel traitées avec oIL-2 les plus distinctes parmi les quatre groupes. c, Fréquence des lymphocytes T CD62L+ o2R ou o9R pmel (Thy1.1+YFP+) des ganglions lymphatiques drainant la tumeur (DLN), de la rate ou des tumeurs de souris traitées avec MSA-oIL2 (sans lymphodéplétion préalable). Les tissus ont été prélevés un ou cinq jours après le transfert adoptif. Montré sont moyenne ± SD avec des points de données individuels (n = 3-5 souris par groupe). **, p < 0,01 ; ***, p < 0,001 ; ****, <0,0001 ; test t non apparié, bilatéral.

a, Schéma des cellules T CD3+ primaires de souris exprimant CAR anti-mésothéline et o2R (CAR-o2R) ou o9R (CAR-o9R). b, expression représentative de la mésothéline CAR (panneau du haut), expression de l'IL-2Rβ (panneau du milieu) et co-expression de CAR/IL-2Rβ (panneau du bas) dans des cellules CAR-o2R et CAR-o9R T non transduites (UTD) ou rétrovirales transduites comme déterminée par cytométrie en flux. Encart du panneau du milieu, intensité de fluorescence moyenne (MFI) de l'IL-2Rβ dans les cellules T non transduites et transduites. c,d, Expansion et phénotype des cellules CAR T o2R et o9R. c, expansion des cellules CAR T in vitro. Les cellules CAR-o2R et CAR-o9R ont été incubées en présence de MSA-IL2 (100 nM) ou MSA-oIL2 (5 μM). Une aliquote de cellules a été retirée de la plaque et colorée avec le colorant de viabilité Calcein AM et comptée quotidiennement sur le cytomètre d'image Celigo. Moyenne ± SEM, n = 3 puits répétés/groupe. d, co-expression de CD44 et CD62L sur les cellules CAR T. Données complètes des diagrammes de flux représentatifs de la figure 3d. Les cellules CAR-o2R et CAR-o9R ont été incubées pendant quatre jours en présence de MSA-IL2 (100 nM) ou MSA-oIL2 (5 μM). La co-expression de surface de CD44 et CD62L a été déterminée par cytométrie en flux sur des cellules CAR+ vivantes. Moyenne ± SEM, n = 3/groupe. ns, non significatif. ****P < 0,0001 (ANOVA). e, Courbes de croissance individuelles des tumeurs PDA7940b par groupe de traitement ; groupes témoins correspondant à la Fig. 3i,j

Données source

a, b, Images représentatives de coupes cérébrales et méningées colorées avec des sondes fluorescentes spécifiques pour la souris CAR (rouge, Cy3), la mésothéline de souris (vert, FITC) et contre-colorées avec DAPI (bleu). Cellules CAR-positives (flèches blanches) et cellules méningées positives à la mésothéline (flèches violettes) indiquées dans la couche pia-arachnoïdienne des méninges. Barres d'échelle, 50 μm. c, d, semi-quantification des cellules CAR T et des cellules positives à la mésothéline dans des coupes de cerveau colorées. Moyenne ± SEM, deux sections/souris, trois souris/groupe. *P < 0,05 (test t bilatéral avec correction de Welch). e, taux sériques de calcium, phosphore, potassium, acide urique et f, cytokines associées au syndrome de libération de cytokines (SRC) au jour 11 du traitement. Moyenne ± SEM, n = 3 souris/groupe. g, Photomicrographies représentatives de 3 souris (160 jours après le traitement) guéries de tumeurs PDA7940b montrant des leptoméninges histologiquement normales, sans infiltrats de cellules immunitaires/inflammatoires, couvrant la région temporo-pariétale des hémisphères cérébraux. H&E, barre d'échelle : 100 μm.

a, Différences de survie entre les souris traitées avec les lymphocytes T CAR-o2R + Ad-oIL2 et CAR-o9R + Ad-oIL2 avec ou sans chimiothérapie de conditionnement. Courbes de survie de Kaplan-Meier des groupes de traitement dans les Fig. 3i–k. **P < 0,01, ****P < 0,0001 (test du log-rank de Mantel-Cox). b, c, Efficacité anti-tumorale de Ad-oIL2 avec des cellules CAR T contrôle ou des cellules Ad-Null et CAR-o2R T. b, Efficacité anti-tumorale chez les souris traitées avec les cellules Ad-oIL2 et CAR T (sans récepteur orthogonal des cytokines). Les tumeurs PDA7940b sous-cutanées établies ont été traitées avec Ad-oIL2 aux jours 0 et 4 (1x109 VP/tumeur) et avec des cellules CAR T au jour 0 (5x106). Moyenne ± SEM, n = 5 souris/groupe. ns, non significatif (ANOVA). c, Efficacité anti-tumorale chez les souris traitées avec des lymphocytes T Ad-Null (sans transgène) et CAR-o2R. Les tumeurs PDA7940b sous-cutanées établies ont été traitées avec Ad-Null aux jours 0 et 4 (1x109 VP/tumeur) et avec des lymphocytes T CAR-o2R au jour 0 (5x106). Moyenne ± SEM, n = 5 souris/groupe. ns, non significatif (ANOVA). d, Volumes tumoraux (moyenne ± SEM) de souris guéries (de la Fig. 3j) rechallenged avec PDA7940b par rapport à des souris naïves appariées selon l'âge (n = 10, 8 et 6 souris pour naïf, Ad-oIL2 + CAR-o2R et Ad- groupes oIL2 + CAR-o9R, respectivement). *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ns, non significatif (ANOVA). e, Quantification des lymphocytes CD45.1+ dans le sang périphérique des souris rechallenged (moyenne ± SEM, n = 10, 8 et 6 souris pour les groupes naïfs, Ad-oIL2 + CAR-o2R et Ad-oIL2 + CAR-o9R, respectivement) . ns, non significatif (ANOVA).

Données source

a, diagrammes de flux de cellules T normales de donneurs sains co-transduites avec ho2R et NYESO1-TCR (à gauche) ou ho9R et NYESO1-TCR (à droite), détectées par l'anticorps anti-humain Vβ13.1 qui reconnaît la chaîne β du NYESO1-TCR clone 1G4 et YFP (marqueur interne des vecteurs o2R ou o9R). Les efficacités de co-transduction sont indiquées. b, réponse à la dose de signalisation pSTAT de cellules T humaines activées non transduites ou ho2R (rouge) ou ho9R (violet) ou non transduites (UTD ; gris) (donneur 651) stimulées avec MSA-hoIL2 (panneau supérieur) ou MSA-hIL2 (panneau inférieur ) pendant 20'. Les données sont présentées sous forme de fluorescence moyenne ± SEM, n = 2. c, Stratégie de déclenchement pour l'immunophénotypage de la population YFP + de cellules T ho2R – NYESO1-TCR et ho9R – NYESO1-TCR illustrée à la Fig. 4c. d, immunophénotype des cellules T humaines modifiées par ho2R – NYESO1-TCR et ho9R – NYESO1-TCR après six jours de culture avec MSA-hoIL2 (1 μM). Les tracés représentatifs de l'expression de CD45RA et CD27 sont contrôlés sur les lymphocytes T YFP + (rangée du haut) et l'expression de CD95 et CCR7 contrôlée sur la population CD45RA + CD27 + (indiquée par une flèche et une ligne pointillée) correspondant au graphique à barres de la figure 4c. e, Immunophénotype des cellules T humaines ho2R – NYESO1 TCR et ho9R – NYESO1 TCR modifiées après deux jours de culture avec MSA-hoIL2 (1 μM). Montré est bar plot quantification des cellules TSCM en pourcentage de la population YFP + (moyenne ± SD, n = 3 répétitions biologiques/groupe). **, p < 0,01 (test t non apparié, bilatéral). f, les cellules T de la Fig. 4e ont été collectées et restimulées avec des dynabeads αCD3 / αCD28, lignée cellulaire de mélanome M407 (HLA * 0201 + NY-ESO-1 +) ou M263 (HLA * 0201 + NY-ESO-1-). L'IFNγ, le TNF et l'IL-2 ont été quantifiés parmi les lymphocytes T YFP+ CD4 (CD8-) par ICS (moyenne ± ET, n = 3 réplicats biologiques/groupe). g, Stratégie de déclenchement pour le tri des flux de cellules T de donneurs sains co-transduites avec des lentivirus exprimant l'anti-mésothéline CAR (M5) et ho2R-GFP/ho9R-GFP (parcelles de gauche). Les tracés de droite indiquent le MFI de l'IL-2Rβ orthogonal dans les cellules doublement positives.

Données source

Ce fichier comprend six tableaux supplémentaires (tableaux supplémentaires 1 à 6) et quatre figures supplémentaires (figures supplémentaires 1 à 4). Les tableaux supplémentaires 1 et 3 comprennent les séquences protéiques des récepteurs chimériques orthogonaux et orthogonaux de souris et humains, respectivement. Les tableaux supplémentaires 2 et 4 comprennent la séquence protéique de la souris orthogonale et de l'IL2 humaine, respectivement. Le tableau supplémentaire 5 comprend une liste des réactifs utilisés dans le manuscrit. Le tableau supplémentaire 6 est une liste des valeurs P exactes du manuscrit. La figure supplémentaire 1 est une analyse complète des images de Western blot résumées à la figure 3b, accompagnée d'une légende de la figure. La figure supplémentaire 2 est la stratégie de déclenchement de cytométrie en flux utilisée pour les données de la figure 1 avec une légende de la figure. La figure supplémentaire 3 est la stratégie de déclenchement de la cytométrie en flux utilisée sur la figure 3k, accompagnée d'une légende de la figure. La figure supplémentaire 4 est la stratégie de déclenchement utilisée pour les données de cytométrie de masse sur la figure 2h et les données étendues sur la figure 5e-f, ainsi qu'une légende de la figure.

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Réimpressions et autorisations

Kalbasi, A., Siurala, M., Su, LL et al. Stimulation de la thérapie cellulaire adoptive à l'aide de récepteurs synthétiques de l'IL-9. Nature 607, 360–365 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04801-2

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Reçu : 20 mars 2021

Accepté : 25 avril 2022

Publié: 08 juin 2022

Date d'émission : 14 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-022-04801-2

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Recherche cellulaire (2022)

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